水稻PHR1家族基因对磷信号和磷平衡综合调控的研究

发布时间：2017-04-02 22:19

  本文关键词：水稻PHR1家族基因对磷信号和磷平衡综合调控的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：磷素(PhosphoRUs,P)是植物生长必需的营养元素,在农业生产中也必不可少外部环境磷养分供应不足会严重影响作物生长,从而导致减产。虽然土壤中磷含量很高,但土壤中磷的不易移动性和低效性使得磷成为植物生长的限制因素,导致农业生产中不得不大量施用磷肥,这不但增加了生产成本,还造成了环境污染。因此培育磷高效的农作物才是保持农业可续发展的重要途径。PHR1(Phosphate StarVation Response 1)在植物磷信号调控网络中作为中心调控因子,通过结合P1BS基序(PHR1 binding site,P1BS)调控植物磷信号与磷平衡。PHR1在不同物种中如何调控磷信号与平衡已有大量研究,但水稻中PHR1家族多基因在磷信号网络中如何协同调控仍不清楚。因此本论文旨在深入探讨水稻PHR1家族基因对磷信号和磷平衡的协同调控机制。通过同源比对分析,本研究在水稻中分析了PHR1的同源基因OsPHR3,其属于MYB-CC家族,位于水稻第2号染色体(2079149-2075496),cDNA全长1404bp,编码468个氨基酸,由7个外显子和6个内含子组成。同时,本研究购买获得了OsPHR3的Tos-17插入突变体(NE300901021A),命名为phr3。利用qRT-PCR和GUS组织切片技术,本研究分析了水稻中三个磷信号调控因子OsPHR1,OSPHR2与OsPHR3(简写为PHR1-3)在不同时期的组织表达特性。qRT-PCR分析表明PHR1-3在水稻整个生长期均表达；叶中OsPHR1和OsPHR2在不同时期的表达差异并不显著；OsPHR3的表达在抽穗期显著诱导。GUS叶片横切表明OsPHR1主要位于维管组织,OsPHR3主要位于维管组织与叶肉细胞,而OsPHR2的表达部位覆盖了OsPHR1和OsPHR3的所有表达部位。由GUS组织切片可知,PHR1-3可能存在功能冗余。因此,为了进一步分析PHR1-3的功能,本研究发展了PHR1-3的相关突变体；单突：phr1、phr2、phr3；双突phr1/2、phr1/3和phr2/3；三突：phr1/2/3。qRT-PCR分析结果可知,phrl、phr2与phr3突变后对OsPHR2下游磷饥饿响应基因OsIPS1、OsPT2和OsmiR827都有不同程度抑制。正常供磷(200μM Pi)条件下,phr2、phr1/2、phr2/3及phr1/2/3生长受到不同程度抑制；phr1、phr2、phr3的有效磷含量与野生型相比无显著差异,而phr1/2/3的有效磷含量显著降低。缺磷(0μMPi)条件下,突变体phr1、phr2、 phr3、phr1/2、phr1/3、phr2/3和phr1/2/3的根毛伸长与野生型相比受到抑制。这些结果说明PHR1-3三个基因存在功能冗余及加性。通过对PHR1-3相关突变体进行基因芯片分析发现,在phrl突变体中,有78基因被诱导,158个基因受到抑制；在phr3突变体中,有169个基因被诱导,155个基因受到抑制。但在三突phr1/2/3中,有2115个基因被诱导,2224个基因受到抑制。而且,在phrl与phr3突变体中,均受到诱导的基因只有33个,受到抑制的有32个；由此说明：OsPHR1、OsPHR2与OsPHR3在下游基因调控方面存在显著的不同。另外,本研究通过PHR1-3的过表达转基因株系分析了其对水稻磷信号与磷平衡的影响。正常供磷(200μM Pi)条件下OsPHR3的增强表达能引起地上部有效磷增加,有效磷含量高于OsPHR1-Ov1,但低于OsPHR2-Ov-1。而在低磷(10μM Pi)培养时叶片有效磷含量与野生型无显著差异,说明OsPHR3参与水稻的磷饥饿响应及磷平衡。正常供磷条件下,OsPHR1、OsPHR2及OsPHR3的增强表达能够诱导缺磷信号,促进根毛的伸长；其中OsPHR2根毛的诱导程度比OsPHR1和OsPHR3显著,这一结果表明三个PHR蛋白的转录能力存在差异。溶液培养发现,在正常磷(200μM Pi)或低磷(10μM Pi)条件下,OsPHR3过表达并不会影响水稻的生长,田间实验分析结果可知,在三个磷梯度实验中OsPHR3过表达株系的生物量及产量均比野生型要高,暗示OsPHR3对于培育耐低磷水稻新品种可能是一个重要候选基因。为此,本研究利用OsPHR3对长江中下游的高产品种秀水134(XS134)进行了遗传改良,结果同样表明OsPHR3改良株系具有耐低磷的特性。为了分析OsPHR3过表达株系耐低磷的分子机制,本研究分析了PHR1-3对PHR1识别元件的亲和力差异。利用酵母单杂(Yeast-one-hybridization)和凝胶阻滞分析(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)技术,发现三个PHR对不同P1BS的亲和力存在差异,其中OsPHR2对P1BS亲和力最高,OsPHRl次之,OsPHR3最弱。PHR1-3的亲和力竞争实验同样说明OsPHR3对识别基序P1BS的亲和力是最弱的。综上所述,本研究揭示了三个转录因子OsPHR1、OsPHR2、OsPHR3对水稻磷信号和磷平衡的协同调控过程。同时发现OsPHR3的增强表达能够提高水稻的耐低磷特性,这为耐低磷作物的遗传改良提供了新的途径。
【关键词】：磷 转录因子 水稻 低磷胁迫
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 致谢10-11
• 摘要11-13
• Abstract13-16
• 缩略语表16-17
• 第1章 文献综述17-29
• 1.1 磷饥饿响应的生理生化变化17-18
• 1.1.1 根形态变化17
• 1.1.2 有机酸及磷酸脂酶17-18
• 1.1.3 磷酸转运体18
• 1.1.4 菌根真菌18
• 1.1.5 体内磷的再利用18
• 1.2 植物对缺磷信号的响应18-22
• 1.2.1 局部磷信号19
• 1.2.2 系统磷信号19-22
• 1.3 Pi饥饿的转录响应及调控22-27
• 1.3.1 缺Pi时的转录响应23-24
• 1.3.2 缺磷响应的转录水平调控24
• 1.3.3 PHR1对Pi饥饿转录响应的重要作用24-25
• 1.3.4 OsPHR2对水稻磷平衡的调控25-26
• 1.3.5 Pi饥饿转录水平调控其他转录因子26-27
• 1.4 本研究的目的及意义27-29
• 第2章 水稻低磷胁迫转录因子OsPHR3基因的生物信息学分析29-33
• 2.1 方法29
• 2.1.1 OsPHR3基因序列分析29
• 2.1.2 OsPHR3与MYB-CC家族蛋白联配分析29
• 2.1.3 OsPHR3与MYB-CC家族基因的系统进化分析29
• 2.2 结果与分析29-31
• 2.2.1 OsPHR3基因结构分析29-30
• 2.2.2 OsPHR3与MYB-CC家族蛋白联配及进化树分析30-31
• 2.3 小结31-33
• 第3章 水稻OsPHR1-3基因表达及组织特异性分析33-43
• 3.1 材料33
• 3.2 方法33-38
• 3.2.1 水稻溶液培养33-34
• 3.2.2 水稻总RNA提取34
• 3.2.3 cDNA第一链合成34
• 3.2.4 水稻基因组DNA提取34
• 3.2.5 GUS表达载体的构建34-35
• 3.2.6 农杆菌侵染法介导的水稻遗传转化35-36
• 3.2.7 GUS染色及显微镜观察36
• 3.2.8 不同生长时期OsPHR1-3基因的表达36-37
• 3.2.9 OsPHR3亚细胞定位分析37-38
• 3.3 结果与分析38-41
• 3.3.1 OsPHR1-3组织特异性分析38-40
• 3.3.2 水稻不同生长时期OsPHR1-3基因表达水平分析40-41
• 3.3.3 OsPHR3亚细胞定位41
• 3.4 小结41-43
• 第4章 phr1、phr2及phr3突变体植株分析43-61
• 4.1 材料43
• 4.2 方法43-47
• 4.2.1 OsPHR1 CRISPR-Cas9载体构建43-44
• 4.2.2 phr3 Tos17插入突变体鉴定44
• 4.2.3 phr1/2,phr1/3,phr2/3双突材料发展及鉴定44
• 4.2.4 phr1/2/3三突材料发展及鉴定44
• 4.2.5 phr突变体对水稻根毛的影响44
• 4.2.6 phr突变体表型分析44-45
• 4.2.7 phr突变体有效磷含量测定45
• 4.2.8 phr突变体中磷信号基因的表达水平分析45
• 4.2.9 phr突变体差异基因表达谱分析45-47
• 4.3 结果与分析47-59
• 4.3.1 phr1突变体鉴定47-48
• 4.3.2 phr3 Tos17插入突变体鉴定48-49
• 4.3.3 phr1/2,phr1/3,phr2/3双突鉴定49-50
• 4.3.4 phr1/2/3三突鉴定50-51
• 4.3.5 phr突变体根毛表型分析51-52
• 4.3.6 phr突变体表型分析52-55
• 4.3.7 phr突变体有效磷含量测定55
• 4.3.8 phr突变体中磷信号基因的表达水平分析55-58
• 4.3.9 phr突变体差异基因表达谱分析58-59
• 4.4 小结59-61
• 第5章 OsPHR1-3过表达转基因植株分析61-73
• 5.1 材料61
• 5.2 方法61-62
• 5.2.1 OsPHR1-3过表达对根毛的影响61
• 5.2.2 OsPHR1-3过表达株系表型分析61
• 5.2.3 PHR1-3过表达株系中缺磷响应基因的表达分析61
• 5.2.4 OsPHR3(ov)田间表型分析61-62
• 5.2.5 OsPHR3(ov)无标记转基因株系田间表型分析62
• 5.2.6 PHR2及PHR3蛋白水平检测62
• 5.3 结果与分析62-72
• 5.3.1 OsPHR1-3过表达对根毛的影响62-63
• 5.3.2 OsPHR1-3过表达转基因株系表型分析63-66
• 5.3.3 PHR1-3过表达株系中缺磷响应基因的表达分析66
• 5.3.4 OsPHR3(ov)田间表型分析66-67
• 5.3.5 OsPHR3无标记转基因株系田间实验67-71
• 5.3.6 PHR2及PHR3蛋白水平分析71-72
• 5.4 小结72-73
• 第6章 顺式作用元件P1BS对不同PHR亲和力的调控73-81
• 6.1 材料73
• 6.1.1 菌株73
• 6.1.2 载体73
• 6.2 方法73-77
• 6.2.1 酵母单杂73-75
• 6.2.2 凝胶阻滞75-77
• 6.3 结果与分析77-79
• 6.4 小结79-81
• 第7章 讨论与展望81-85
• 7.1 OsPHR1,OsPHR2和OsPHR3功能冗余81-82
• 7.2 OsPHR1,OsPHR2和OsPHR3功能多样性82-83
• 7.3 水稻OsPHR3过表达能耐低磷83-85
• 参考文献85-97
• 附录97-101
• 附录1 引物总汇97-101
• 作者简历101

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 ;Characterization of the promoter of phosphate transporter TaPHT1.2 differentially expressed in wheat varieties[J];遗传学报;2009年08期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 周洁;水稻低磷胁迫相关转录因子OsPHR1和OsPHR2的功能研究[D];浙江大学;2007年

  本文关键词：水稻PHR1家族基因对磷信号和磷平衡综合调控的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：283260