创建快速进化策略研究卤醇脱卤酶碳末端功能

发布时间：2017-04-02 22:13

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【摘要】：卤醇脱卤酶,是一类存在于微生物降解有机卤化合物代谢途径中的关键酶之一,它不仅可以通过分子内亲核取代机制,催化邻卤醇转化生成环氧化物和卤化氢,还能在一系列亲核试剂N3-、CN-和NO2-等介导下,高效高选择地催化其逆反应-环氧化物的开环反应,可以用来合成光学纯的环氧化物以及β-取代醇等一系列高价值手性药物中间体。因此,该酶具有十分重要的工业应用前景。通过对目前研究较为广泛的三类卤醇脱卤酶进行氨基酸序列同源性比对分析,我们发现来源于放射形土壤农杆菌(Agrobacterium radiobacter AD1)中的卤醇脱卤酶(Hhe C),在其碳末端与另两类卤醇脱卤酶存在着显著的序列特征差异,即前者拥有长于另两类酶约10个氨基酸的碳末端区域。相关研究表明,这段看似冗长的碳末端区域,对卤醇脱卤酶行使催化功能具有十分重要的作用,但对其具体的调控机制还缺乏深入地研究。为了更高效地研究碳末端的具体功能,本论文在迭代式饱和突变策略(Iterative Saturation Mutagenesis,ISM)的基础上,创建了两种多位点快速进化策略。通过运用相关策略,系统地研究和揭示了卤醇脱卤酶碳末端的具体功能以及相应的调控机制。具体研究内容如下:(1)使用定点缺失突变技术,逐一研究卤醇脱卤酶碳末端区域每个氨基酸位点在酶催化反应过程中的作用。对所获得的10个碳末端氨基酸缺失突变体Δ1~Δ10,进行了表达纯化和功能检测。研究发现:碳末端氨基酸的缺失,对卤醇脱卤酶的催化活性有相当显著的负效应,其中缺失突变体Δ7~Δ10几乎完全丧失了催化活性。此外,碳末端氨基酸缺失后,还对酶的热稳定性具有十分显著的负效应。这些结果表明,该碳末端区域对卤醇脱卤酶行使催化功能是必不可少的。(2)使用单点饱和突变技术,系统地研究卤醇脱卤酶碳末端区域每个氨基酸位点在酶催化反应过程中的具体功能及调控机制。通过基于酶催化活性和热稳定性的文库筛选,获得了20个单点优势突变体,并对其进行表达纯化和功能检测。研究发现:碳末端关键氨基酸位点249和252~254发生突变后,对卤醇脱卤酶的催化活性和热稳定性分别具有十分明显地增强作用,证实了碳末端区域对催化活性和热稳定性均具有一定的调控功能。其中,碳末端关键氨基酸位点253和254,被证实能够在不影响卤醇脱卤酶催化活性情形下,独立地调控酶的热稳定性。同源建模分析发现,优势突变体P253D和P253N,在氨基酸位点253和254之间增加了两个氢键,能够较好地稳定整个碳末端区域的构象,使得它们的热稳定性明显改善。相关结果表明:碳末端区域内氨基酸之间的氢键网络,对其维持和调控卤醇脱卤酶的热稳定性有着不可替代的作用。(3)创建高效的多位点快速进化策略,用于后续进一步研究和调控卤醇脱卤酶碳末端功能。首先,在ISM策略的基础上,结合简并密码子设计工具DC-Analyzer,创建了非连续多位点快速进化策略,并成功用于增强卤醇脱卤酶的催化活性实例中。在对5个氨基酸位点的改造研究中,通过筛选约900个单克隆,获得了催化活性较野生型提高9.3倍的高效突变体。但是,该策略用于含有多个连续或者相邻位点的改造研究时,基于DC-Analyzer所设计的引物数目会大大增加。随后,针对DC-Analyzer的应用局限,成功地开发了适用于连读多位点突变重组的简并密码子工具MDC-Analyzer。在此基础上,创建了连续多位点快速进化策略,并成功运用于提高卤醇脱卤酶的催化活性以及热稳定性实例中。在对6个和7个氨基酸位点的改造研究中,通过筛选1,151和384个单克隆,分别获得了高于其模板5.9倍催化活性和2.3倍热失活半衰期的高效突变体。这些结果表明,本论文所创建的快速进化策略,能够高效便捷地用于快速提高生物催化剂的催化特性。(4)运用所创建的快速进化策略,研究卤醇脱卤酶碳末端区域关键氨基酸位点245,249,252,253和254的重组效应,进一步地调控和改善酶的催化活性以及热稳定性。首先,使用非连续多位点快速进化策略,研究碳末端区域关键氨基酸位点245、249和252的重组效应。研究发现,这3个氨基酸位点对酶的催化活性和热稳定性都有相当明显的加和效应,并且筛选获得了高于野生型卤醇脱卤酶5.0倍催化活性以及3.1倍热失活半衰期的高效突变体DL10。随后,运用连续多位点快速进化策略,在DL10的基础上,进一步研究关键氨基酸位点253和254的重组效应。研究发现,这2个氨基酸位点发生突变后,能够在不影响DL10催化活性的前提下,独立地调控酶的热稳定性,并且筛选获得了高于野生型卤醇脱卤酶4.0倍催化活性以及17.8倍热失活半衰期的高效突变体PX14。可见,碳末端氨基酸调控卤醇脱卤酶的催化活性和热稳定性具有可叠加性。综上所述,本论文选取来源于放射形土壤农杆菌中的卤醇脱卤酶碳末端作为研究模型,系统地研究了该碳末端区域在卤醇脱卤酶行使催化反应过程中的具体功能,揭示了其对酶的催化活性以及热稳定性的调控机制。运用所创建的多位点快速进化策略,成功地筛选获得了多个催化活性和热稳定性得以同时增强的高效突变体,这将有助于推动卤醇脱卤酶的理论研究和实际工业生产应用。
【关键词】：卤醇脱卤酶 碳末端功能 单点饱和突变 多位点重组 快速进化策略
【学位授予单位】：电子科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q55
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-14
• 第一章 绪论14-22
• 1.1 卤醇脱卤酶的概述14-18
• 1.1.1 卤醇脱卤酶的简介14
• 1.1.2 卤醇脱卤酶的分类14-15
• 1.1.3 卤醇脱卤酶的催化机理15-16
• 1.1.4 卤醇脱卤酶的应用研究16-18
• 1.1.4.1 卤醇脱卤酶脱卤反应的应用研究16
• 1.1.4.2 卤醇脱卤酶开环反应的应用研究16-17
• 1.1.4.3 卤醇脱卤酶工业应用的拓展研究17-18
• 1.2 酶进化策略概述18-20
• 1.2.1 理性进化策略概述18
• 1.2.2 非理性进化策略概述18-19
• 1.2.3 半理性进化策略概述19-20
• 1.3 本论文的主要内容20
• 1.4 本研究意义和目的20-21
• 1.5 本论文的结构安排21-22
• 第二章 实验材料和方法22-34
• 2.1 实验材料22
• 2.2 实验试剂22
• 2.3 溶液配制22-25
• 2.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测实验溶液配制22
• 2.3.2 转化感受态细胞制备实验溶液配制22-23
• 2.3.3 突变体文库比色筛选实验溶液配制23
• 2.3.4 突变体表达及纯化实验溶液配制23
• 2.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验溶液配制23-24
• 2.3.6 酶活性测定实验溶液配制24-25
• 2.4 实验方法25-34
• 2.4.1 卤醇脱卤酶突变体基因扩增25-27
• 2.4.1.1 PCR扩增卤醇脱卤酶突变体基因25-26
• 2.4.1.2 琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果26
• 2.4.1.3 琼脂糖凝胶回收PCR扩增片段26
• 2.4.1.4 限制性内切酶消化PCR产物26-27
• 2.4.2 卤醇脱卤酶突变体文库构建及筛选27-30
• 2.4.2.1 卤醇脱卤酶突变体文库构建27-28
• 2.4.2.2 卤醇脱卤酶突变体文库筛选28-29
• 2.4.2.3 卤醇脱卤酶突变体质粒提取29-30
• 2.4.3 卤醇脱卤酶突变体诱导表达及纯化30-32
• 2.4.3.1 卤醇脱卤酶突变体诱导表达30
• 2.4.3.2 阴离子交换层析纯化酶蛋白30-31
• 2.4.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化效果31-32
• 2.4.3.4 紫外法测定纯化酶蛋白浓度32
• 2.4.4 卤醇脱卤酶催化活性和热稳定性测定32-34
• 第三章 卤醇脱卤酶碳末端功能研究34-52
• 3.1 概述34
• 3.2 实验材料和方法34-35
• 3.3 实验结果和分析35-49
• 3.3.1 卤醇脱卤酶碳末端功能研究区域的选择35-36
• 3.3.2 碳末端缺失突变体功能研究36-39
• 3.3.2.1 碳末端缺失突变体构建36-38
• 3.3.2.2 碳末端缺失突变体表达纯化及功能检测38-39
• 3.3.3 碳末端单点饱和突变研究39-49
• 3.3.3.1 单点饱和突变体文库构建39-41
• 3.3.3.2 单点饱和突变体文库筛选41-42
• 3.3.3.3 优势突变体表达纯化及功能检测42-44
• 3.3.3.4 优势突变体结构与计算分析44-49
• 3.4 讨论49-51
• 3.5 小结51-52
• 第四章 创建非连续多位点快速进化策略52-66
• 4.1 概述52
• 4.2 实验材料和方法52-53
• 4.3 实验结果和分析53-62
• 4.3.1 常见的多位点重组进化策略比较53-54
• 4.3.2 创建非连续多位点快速进化策略54-55
• 4.3.3 非连续多位点快速进化策略运用实例55-61
• 4.3.3.1 多位点快速进化改造的区域选择55
• 4.3.3.2 单点饱和突变体文库构建及筛选55-58
• 4.3.3.3 多位点快速重组引物设计58
• 4.3.3.4 多位点重组突变体文库构建及筛选58-59
• 4.3.3.5 多位点重组突变体表达纯化及酶活检测59-61
• 4.3.4 迭代式饱和突变策略实例对比研究61-62
• 4.3.4.1 迭代式饱和突变策略的实施流程61
• 4.3.4.2 迭代式饱和突变策略的实例对比61-62
• 4.4 讨论62-65
• 4.5 小结65-66
• 第五章 创建连续多位点快速进化策略66-82
• 5.1 概述66
• 5.2 实验材料和方法66-67
• 5.3 实验结果和分析67-78
• 5.3.1 多位点重组简并密码子工具的设计67-69
• 5.3.2 创建连续多位点快速进化策略69-70
• 5.3.3 连续多位点快速进化策略运用实例一70-75
• 5.3.3.1 多位点快速进化改造的区域选择70
• 5.3.3.2 单点饱和突变体文库构建及筛选70-72
• 5.3.3.3 多位点快速重组突变引物设计72-73
• 5.3.3.4 多位点重组突变体文库构建及筛选73-74
• 5.3.3.5 多位点重组突变体表达纯化及酶活检测74-75
• 5.3.4 连续多位点快速进化策略运用实例二75-78
• 5.3.4.1 多位点快速进化改造的区域选择75-77
• 5.3.4.2 多位点快速重组引物设计77
• 5.3.4.3 多位点重组突变体文库构建及筛选77-78
• 5.3.4.4 多位点重组突变体表达纯化及功能检测78
• 5.4 讨论78-81
• 5.5 小结81-82
• 第六章 卤醇脱卤酶碳末端多位点重组研究82-92
• 6.1 概述82
• 6.2 实验材料和方法82-83
• 6.3 实验结果和分析83-89
• 6.3.1 碳末端非连续多位点快速进化研究83-85
• 6.3.1.1 非连续多位点快速重组引物设计83-84
• 6.3.1.2 非连续多位点重组突变体文库构建及筛选84
• 6.3.1.3 非连续多位点重组突变体表达纯化及功能检测84-85
• 6.3.2 碳末端连续多位点快速进化研究85-87
• 6.3.2.1 连续多位点快速重组引物设计85
• 6.3.2.2 连续多位点重组突变体文库构建及筛选85-86
• 6.3.2.3 连续多位点重组突变体表达纯化及功能检测86-87
• 6.3.3 碳末端多位点重组突变体结构分析87-89
• 6.4 讨论89-90
• 6.5 小结90-92
• 第七章 结论92-94
• 7.1 本论文的主要结论92-93
• 7.2 下一步工作的展望93-94
• 致谢94-95
• 参考文献95-108
• 攻读博士学位期间取得的成果108-109

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