A549细胞对外源金属离子刺激响应信号转导过程的蛋白质组学研究

发布时间：2020-10-09 07:22

　　细胞通过激活一系列的生物过程,包括新陈代谢、转录、生长和分化等,对各种各样的外源性刺激如金属压力、生长因子和激素的刺激等产生响应。必需金属元素的过量或缺乏,或者非必需金属元素的存在都将干扰这些响应信号行使正确的生物功能。非必需金属元素,如镉、汞、铅,即使痕量的存在,它们对生物体也形成一定的毒性。而必需金属元素,如锌和铜,它们虽然是蛋白质,尤其是酶和转录因子不可缺少的一部分,但是过量锌、铜的存在也会对生物体形成毒性。因此,细胞进化并形成了输入、屏蔽、存储、转运及排出重金属元素这一精细的调节金属平衡的生物系统。所有生物都能够由这一自平衡调节系统调整它们体内相关基因组或蛋白质组的表达模式,对外源性的重金属刺激或压力做出适应性的响应,以减少或避免金属刺激的损害。这些基因组或蛋白质组的金属诱导表达模式不仅具有组织、细胞、浓度特异性,而且具有时间依赖性。观察细胞内基因、蛋白质和金属元素的时间依赖性差异表达和变化有助于了解细胞对外源刺激的动态响应过程,对探索自平衡调节和防御以及细胞毒性机制具有重要意义。本论文以A549细胞系作为细胞模型,运用高通量、高分辨的双向凝胶电泳-质谱(2DE-MS)蛋白质组学的方法描绘了A549细胞暴露于外源金属离子后,细胞内蛋白质组对外源重金属离子必需元素锌和非必需元素镉刺激产生的时间依赖性响应,并采用Western blot和RT-PCR技术研究了A549细胞中锌离子自平衡调节蛋白质及其mRNA和镉毒性蛋白质及其mRNA对金属离子响应的时间依赖性变化,同时运用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和共聚焦显微成像技术研究了细胞内重金属元素或离子的含量在细胞内的时间依赖性变化,探索了细胞对金属离子暴露产生的时间依赖性动态响应的过程。本论文的工作主要包括以下5个部分：(1)运用基质辅助激光解吸串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF)一级质谱(MS)分析了杆菌肽锌的主要成份；在优化的仪器条件下,利用单张二级质谱图(MS/MS)获得了具有复杂结构的十二金属环肽杆菌肽锌A的一级结构中氨基酸的序列信息；运用从头序列解析(De novo sequencing)的方法对多肽进行了氨基酸序列的分析和确认。此外,运用红外光谱、紫外光谱、电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)等方法进一步分析表征了这个典型金属多肽抗生素的结构。(2)运用Western blot和RT-PCR技术研究了锌平衡信号通路中关键蛋白质金属转录因子(MTF-1)、金属硫蛋白(MT-1)以及Zn转运子(ZnT-1和ZIP-1)在mRNA水平和蛋白质水平对外源锌刺激呈现出的时间依赖性差异表达,发现了它们所具有的对外源锌刺激产生的时间依赖性表达的特性。这些蛋白质的表达随着外源锌刺激时间的不同发生保守的变化,其表达主要受锌刺激的诱导,并且均在外源锌刺激细胞9 h后呈现最大的变化,基于此,推测了由这些关键蛋白质调控的Zn的自稳态调节过程。(3)运用结合硝酸银染色和考马斯亮蓝染色的2DE技术分别呈现了外源.锌刺激A549细胞不同时间后细胞全蛋白质差异表达谱,并对差异表达蛋白质点的差异表达情况进行归类和统计分析,发现了以两种表达模式为主的四种表达类型,总结出差异表达蛋白质在细胞暴露于24 h后的表达总是低于9 h,即外源锌长时间刺激细胞能够导致差异表达蛋白质表达的进一步降低这一差异表达规律,据此,指出蛋白质时间依赖性表达的特性对金属离子响应的蛋白质组学研究具有重要影响;运用MALDI-TOF/TOF和Mascot数据库搜索对差异表达蛋白质点进行了分析和鉴定,并对已鉴定差异表达蛋白质进行了生物过程和分子功能等功能分类分析,进一步了解外源锌刺激涉及的细胞内的信号转导过程。(4)运用Bradford和ICP-MS技术研究了全细胞、细胞质、细胞核内总蛋白质表达量的时间依赖性变化规律,并运用共聚焦显微成像技术研究了自由Zn(Ⅱ)在细胞中的含量和分布时间依赖性的变化情况,进一步验证了细胞对外源锌刺激因适应性反应表现出的时间依赖性响应特性,并探索了调节细胞内Zn(Ⅱ)平衡的信号转导过程。(5)与对细胞暴露外源锌的研究类似,我们首先获得了外源毒性重金属离子Cd(Ⅱ)刺激A549细胞后的细胞全蛋白质差异表达谱,研究了相关差异蛋白质对外源金属离子刺激的时间依赖性响应的规律,类似地,发现了差异表达蛋白质的四种表达模式,但Cd(Ⅱ)响应蛋白质组表达模式与规律和Zn(Ⅱ)响应具有显著不同的特点：(1)这些蛋白质的表达随着外源镉刺激时间的不同发生保守的变化,其表达同样主要受镉刺激的诱导,但均在外源镉刺激细胞24 h后呈现最大的变化；(2)外源镉长时间刺激细胞(24 h)比短时间(4.5 h)导致差异表达蛋白质表达的变化增大；运用Western blot、RT-PCR、Bradford和ICP-MS技术进一步研究了细胞内关键镉毒性蛋白质的表达变化,细胞中总蛋白质浓度以及Cd、Zn、Cu、Co、Mn等金属离子含量的时间依赖性的变化情况,初步探讨了产生镉毒性的信号过程。研究结果表明,细胞及其内的蛋白质组对外源性金属离子刺激的响应尽管有所不同,但均呈现出特异性的时间依赖性。我们发现,这种适应性应激反应所引起的时间依赖的特异性响应和表达在蛋白质组研究和信号机制研究中具有重要的意义,将为研究细胞内金属自平衡调节和毒性提供一个新的角度。
【学位单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q25
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
第一章绪论
    1.1 前言
    1.2 金属的分布和危害
    1.3 锌（Zn）
        1.3.1 锌的分布和来源
        1.3.2 锌的生物必需性和生物毒性
        1.3.3 锌的分子生物功能
        1.3.4 锌的动态自平衡调节
        1.3.5 锌自调节平衡相关的关键蛋白质
            1.3.5.1 金属硫蛋白质（MT）
            1.3.5.2 锌铁调控蛋白质（ZIPs）
            1.3.5.3 锌铁调控蛋白质（ZnTs）
            1.3.5.4 金属响应转录因子1（MTF-1）
    1.4 镉（Cd）
        1.4.1 镉的分布和来源
        1.4.2 镉对人体健康的影响
        1.4.3 镉毒性的分子机理
        1.4.4 镉毒性相关主要生物分子
            1.4.4.1 酶
            1.4.4.2 谷胱甘肽
            1.4.4.3 热应激蛋白质
            1.4.4.4 金属硫蛋白
    1.5 蛋白质组学
        1.5.1 蛋白质组学的起源
        1.5.2 蛋白质组学的分类
        1.5.3 差异蛋白质组学
        1.5.4 研究差异蛋白质组学的主要技术
            1.5.4.1 二维凝胶电泳
            1.5.4.2 样品的制备
            1.5.4.3 等电聚焦
            1.5.4.4 SDS-PAGE
            1.5.4.5 凝胶图像的可视化
        1.5.5 生物质谱技术
        1.5.6 生物信息学分析
    1.6 其它蛋白质组学研究技术与方法
        1.6.1 荧光差异凝胶电泳（DIGE）
        1.6.2 iTRAQ技术
        1.6.3 蛋白质芯片
        1.6.4 蛋白质组学的现状和发展
    1.7 蛋白质组学在重金属毒性研究中的意义
        1.7.1 蛋白质组学在重金属毒性研究中的优势
        1.7.2 蛋白质组学在重金属毒性研究中的应用
    1.8 选题思想和研究内容
    参考文献
第二章杆菌肽锌的序列解析和光谱表征
    摘要
    2.1 前言
    2.2 实验部分
        2.2.1 材料和试剂
        2.2.2 仪器和实验条件
    2.3 结果和讨论
        2.3.1 仪器条件的优化
        2.3.2 杆菌肽锌的一级质谱
        2.3.3 多肽序列离子和碎片离子的定义
        2.3.4 杆菌肽A的MS/MS从头测序分析
        2.3.5 杆菌肽锌的紫外光谱
        2.3.6 杆菌肽锌的红外光谱
        2.3.7 电感耦合等离子体发射光谱分析杆菌肽锌中的锌元素
    2.4 结论
    参考文献
第三章锌响应蛋白质组及其调控蛋白质的时间依赖性表达
    摘要
    3.1 前言
    3.2 实验部分
        3.2.1 实验材料和试剂
        3.2.2 实验方法
            3.2.2.1 细胞培养
            3.2.2.2 外源锌对细胞的压力
            3.2.2.3 细胞活性分析
            3.2.2.4 2DE和Western blot蛋白质样品的制备
            3.2.2.5 二维凝胶电泳和图像分析
            3.2.2.6 蛋白质鉴定
            3.2.2.7 Western blot
            3.2.2.8 RT-PCR
            3.2.2.9 统计分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 细胞活性
        3.3.2 二维凝胶电泳和蛋白质鉴定
        3.3.3 差异蛋白质的功能分析
        3.3.4 Western blot
        3.3.5 RT-PCR
    3.4 讨论
    3.5 结论
    参考文献
第四章 A549细胞及其蛋白质组对外源锌刺激的动态响应
    摘要
    4.1 前言
    4.2 实验部分
        4.2.1 实验材料和试剂
        4.2.2 实验方法
            4.2.2.1 细胞培养
            4.2.2.2 外源锌对细胞的压力
            4.2.2.3 细胞活性分析
            4.2.2.4 蛋白质样品的制备
            4.2.2.5 二维凝胶电泳和图像分析
            4.2.2.6 蛋白质鉴定
            4.2.2.7 Western blot
            4.2.2.8 锌含量的测定
2+的共聚焦成像'>            4.2.2.9 细胞内自由Zn²⁺的共聚焦成像
            4.2.2.10 统计分析
    4.3 实验结果
        4.3.1 细胞活性
        4.3.2 锌响应蛋白质的表达模式
        4.3.3 差异表达蛋白质的鉴定和功能分组
        4.3.4 蛋白质HSP90α和hnRNPA1的表达模式
        4.3.5 差异蛋白质浓度的测定
        4.3.6 差异Zn含量的测定
2+的观测'>        4.3.7 细胞内自由Zn²⁺的观测
    4.4 讨论
    4.5 结论
    参考文献
第五章 A549细胞及其蛋白质组对外源镉刺激的动态响应
    摘要
    5.1 前言
    5.2 实验部分
        5.2.1 实验材料和试剂
        5.2.2 实验方法
            5.2.2.1 细胞培养
            5.2.2.2 外源镉对细胞的压力
            5.2.2.3 细胞活性分析
            5.2.2.4 蛋白质样品的制备
            5.2.2.5 二维凝胶电泳和图像分析
            5.2.2.6 蛋白质鉴定
            5.2.2.7 Western Blot
            5.2.2.8 Cd、Zn、Cu、Co、Mn含量的测定
            5.2.2.9 RT-PCR
            5.2.2.10 统计分析
    5.3 实验结果
        5.3.1 细胞活性
        5.3.2 镉响应蛋白质的表达模式
        5.3.3 差异表达蛋白质的鉴定和功能分组
        5.3.4 差异蛋白质浓度的测定
        5.3.5 蛋白质HSP90α和hnRNPA1的表达模式
        5.3.6 差异镉含量和必需金属含量的测定
        5.3.7 MT-1和ZIP-8的差异表达
    5.4 讨论
    5.5 结论
    参考文献
结论
致谢
附录A
附录B

【参考文献】