植物中紫杉二烯合酶基因的功能分析及进化探究

发布时间：2020-10-10 11:09

　　 紫杉-4(5),11(12)-二烯合酶(Taxa-4(5),11(12)-diene synthease,TS)是紫杉醇生物合成中关键的限速酶,可以催化牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)环化成紫杉烷类化合物的基本骨架紫杉-4(5),11(12)-二烯。紫杉二烯合酶基因TS在植物中的存在是该种植物能够合成紫杉醇的分子层面的最好证据。本研究利用高通量测序技术测得报道检测到紫杉醇的植物白豆杉(Pseudotaxus chienii)、穗花杉(Amentotaxus argotaenia)、香榧(Torreya grandis)转录组,通过对这些植物和平榛(Corylus heterophylla Fisch)的转录组数据进行TS基因的预测,并利用体外表达体系对其进行功能鉴定。通过实验发现,我们筛选的TS候选基因中只有白豆杉中表达的PchTS具有紫杉二烯合酶的功能。本实验室对粗榧的CsTSL研究发现其能够催化GGPP得到verticiol,而在本研究中发现白豆杉中的PchTS能够催化GGPP得到紫杉二烯。此结果是否说明存在紫杉二烯合酶基因在不同植物中的进化现象?通过活性位点分析发现南方红豆杉(Taxus chinensis(Pilger)Rehd)中的TchTS和粗榧中的CsTSL之间存在两个活性位点的不同,这两个位点都存在于具有结合及催化活性的α结构域内。我们进一步用TchTS的α结构域换掉CsTSL的α结构域,看能否实现其TS功能的回补。但是,粗榧CsTSL的α结构域置换实验并未达到CsTSL回补TS功能的效果。本研究通过对这些TS候选基因分析发现古老的二萜合酶TS可能在植物中不是普遍存在的。本文主要研究结果如下:1.对白豆杉进行转录组测序,并对预测的TS候选基因进行功能验证。首先对白豆杉转录组测序,共得到约8.60 Gb的Clean data,组装得到78,192条Unigene。通过对白豆杉的转录组注释分析发现42,465条Unigene至少被注释到一个数据库。KEGG注释发现有63条Unigene被注释到萜类骨架生物合成中,有19条Unigene注释到了二萜生物合成途径中。我们利用已知的紫杉醇合成途径基因序列信息,通过对白豆杉转录组的分析预测得到了3个紫杉二烯合酶同源基因、6个羟基化酶同源基因、4个酰基转移酶同源基因、3个苯丙氨酸氨基变位酶基因同源基因和5个R-β-苯丙氨酸辅酶A连接酶。然后,克隆得到与TchTS基因同源性最高的PchTS基因,并对其进行功能验证,发现PchTS具有紫杉二烯合酶的功能。最后,我们对白豆杉树皮的化学成分分析,并未检测到紫杉醇。这有可能是白豆杉中紫杉醇合成途径下游的某个酶功能缺失或沉默造成的。2.对穗花杉进行转录组测序,并对预测的ts候选基因进行功能验证。首先对穗花杉转录组测序,共得到8.14gb的cleandata,组装得到82,884条unigene。其中,有27,495条unigene至少得到一个数据库的注释。kegg注释发现有43条unigene被注释到萜类骨架生物合成中,有20条unigene注释到了二萜生物合成途径中。同时,kegg注释得到5个ggps基因。利用tchts蛋白质序列对穗花杉的转录组进行分析,预测得到13个紫杉二烯合酶同源基因。然后,利用race技术克隆了穗花杉中同源性最高的基因aartsl1的全长克隆,并对其进行功能验证,发现aartsl1不具有紫杉二烯合酶的功能。最后,我们对穗花杉树皮的化学成分分析,并未检测到紫杉醇。这说明穗花杉可能不具有合成紫杉醇的能力。3.对香榧进行转录组测序,并对预测的ts候选基因进行功能验证。首先对香榧转录组测序,共得到7.68gb的cleandata,组装得到85,984条unigene。其中有29,418条unigene得到至少一个数据库的注释。kegg注释发现共有5,893个unigene得到注释。利用blast技术对香榧转录组进行分析,其中发现了3个紫杉二烯合酶同源基因。然后,克隆得到与tchts基因同源性最高的tgrtsl1基因,并对其进行功能验证,发现tgrtsl1不具有紫杉二烯合酶的功能。最后,我们对香榧树皮的化学成分分析,并未检测到紫杉醇。这说明香榧可能不具有合成紫杉醇的能力。4.对平榛(c.heterophylla)中的tsl基因进行功能研究。首先,通过分析平榛转录组得到一个ts基因候选unigene。然后利用race-pcr技术克隆得到基因全长,并命名为chetsl。然后,利用原核表达体系对其进行功能验证,发现chetsl不具有紫杉二烯合酶的功能。但是,进一步分析发现该基因是一个贝壳杉烯合酶(kaurenesynthase,ks)基因。目前,仍然没有人能够从榛属植物中克隆得到ts基因,所以榛属植物中紫杉醇的来源仍然是一个迷。5.对tchts、pchts和cstsl蛋白进行活性位点研究。首先,利用分子对接技术对紫杉二烯合酶具有活性的α结构域进行分析,分析上述三个蛋白的α结构域的活性位点,从中找出它们之间存在差异的活性位点。通过用2-氟代牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸(2-fluorogeranylgeranyldiphosphate,fgp)与tchts、pchts和cstsl蛋白进行分子对接,发现红豆杉中TchTS与白豆杉中PchTS的活性位点完全一样。然而,粗榧中CsTSL与红豆杉中的TS之间有2个活性位点的差异,分别是TchTS的VAL610与CsTSL的PHE637,和TchTS的PHE834与CsTSL的ILE860。分析发现这两个具有差异的活性位点恰好都位于α结构域内。因此,我们进一步利用具有活性的TchTS的α结构域换掉CsTSL的α结构域试图回补CsTSL的TS功能,但是该实验并未能够回补CsTSL的TS功能。最后,我们对粗榧树皮的化学成分进行了分析并未检测到紫杉醇。CsTSL基因可能是粗榧中进化后失去功能的紫杉二烯合酶基因。
【学位单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2016
【中图分类】：Q946
【部分图文】：

Tab. 2-2 The statistical result of functional annotation of P. chienii Unigene注释用数据库Anno_Database注释的 Unigene 数目Annotated_Number300<=长度<1000300<=length

第二章 基于转录组测序的紫杉二烯合酶候选基因的发掘metabolism）和“氨基酸的运输和代谢”（amino acid transport and metabolism）是最大的 个类群，分别有 3,836、1,767 和 1,669 条 Unigene。然而，“胞外结构（”extracellular structures是最小的类群，只有 1 条 Unigene（图 2-1）。对 78,192 条 Unigene 进行 GO 功能注释，其中有 23,454 条 Unigene 分别注释到 5个功能组，归纳为生物学过程（biological process）、细胞组分（cellular component）和分子功能（molecular function）三大部分，分别含有 20、16 及 16 个功能组。在生物学过程部分中注释的 Unigene 数目最多的过程是：代谢过程（metabolic process）和细胞过程（cellular process），分别为 16,540 和 12,948 条；在细胞组分部分中注释的 Unigene 数目多的功能组是：细胞组分（cell part）和细胞（cell）功能组，分别为 9,544 和 9,460 条；在分子功能部分中，催化活性（catalytic activity）和结合（binding）功能组分别含有 13,54和 11,010 条（图 2-2）。

图 2-3 红豆杉紫杉二烯合酶及白豆杉中的同源蛋白序列分析豆杉中紫杉二烯合酶的同源基因的多序列比对；B：白豆杉中紫杉二烯合酶的e protein sequences analysis of TchTS in T. chinensis and the homologous protein ochieni.omparison of the deduced amino acid sequence of the three putative TS genes in P. : Phylogenetic analysis of the TS genes in P. chienii and T. chinensis.
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4 ;[J];;年期

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本文编号：2835101