食源性单核增生性李斯特氏菌的分布、遗传多态性及其毒理机制研究

发布时间：2020-10-11 22:45

　　 单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria moncytogenes,Lm)是一种重要的食源性病原菌,由于其具有分布广、耐受力强、高致病力等特点而备受食品安全领域关注。为了探明保定、石家庄及周边地区食源性单增李斯特菌的污染状况;探明该地区食源性单增李斯特菌的遗传多态性;了解食源性单增李斯特菌的毒力基因分布状况、毒力基因在其生长周期中不同时间点的表达规律、在不同宿主条件下毒力基因表达水平以及食源性单增李斯特菌的致病力等情况。本研究对从保定、石家庄及周边地区农贸市场、超市采集七大类食品共1288个样品进行单增李斯特菌的污染调查;对鉴定分离出的308株食源性单增李斯特菌的27个毒力基因的分布情况进行了PCR检测;采用RAPD法对308株食源性单增李斯特菌的遗传多态性进行分析,并采用不加权成对算数平均法(UPAMA)进行聚类分析;采用实时荧光定量PCR技术(q RT-PCR)对其主要毒力基因的表达量进行了时序性表达研究;采用天然肉汤培养及荧光定量PCR分析法对单增李斯特菌在不同宿主条件下主要毒力基因表达水平进行研究;采用小鼠毒力实验对一些毒力基因缺失株单增李斯特菌进行致病力实验。通过本研究得到如下结论:(1)通过对保定、石家庄地区七大类食品中单增李斯特菌的污染调查表明:单增李斯特菌在该地区食品中的平均检出率为23.91%,其中生肉高达40.60%,熟肉制品和水产品分别达到25.42%和23.46%,而其他食品中较少;动物源食品检出率高于植物源食品。(2)优化并建立了单增李斯特菌的RAPD分型方法,得出了308株食源性单增李斯特菌的DNA指纹图谱,根据菌株之间的亲缘关系制作食源性单增李斯特菌的遗传进化树;(3)通过对308株食源性单增李斯特菌的RAPD遗传多态性分析,可将308株单增李斯特菌分成6个基因类群,其中第Ⅱ聚类和第I聚类为保定、石家庄地区的优势种群;食源性单增李斯特菌具有一定的寄主偏好性,其传播流行具有明显的时间性和地域性;(4)通过对七大类食品中308株单增李斯特菌分离株中的27个毒力基因的PCR检测发现:与侵入、感染有关的毒力基因在动物源食品分离株中分布明显高于植物源食品分离株中;与黏附、调控有关的毒力基因在两者中差别不明显;该地区属于Ⅰ型的单增李斯特菌其毒力基因的平均含量要高于Ⅱ型的菌株;该地区食源性单增李斯特菌分离株中hfq、dlt C和iap检出率最高,可作为该地区食源性单增李斯特菌鉴定的参考基因;(5)单增李斯特菌的毒力基因表达量在菌体生长的稳定期后期(16 h~18 h)达到高峰,以后表达量逐渐降低,但直到菌体生长衰亡期仍保持较高表达量;在猪、鸡、牛、羊四种肉汤培养基中毒力基因表达水平差异明显,表明单增李斯特菌在不同宿主条件下其毒力基因表达量不同;(6)毒理试验结果表明:hly A基因对单增李斯特菌的致病力具有决定性作用,inl A、prf A和vir R基因对单增李斯特菌的致病力影响较大,而plc A,act A、plc B、dlt A、dlt D等基因对单增李斯特菌致病力均有影响但相对较小。本论文研究成果将为食源性单增李斯特菌的预防、检测、溯源以及食品安全提供重要的基础数据和理论支持。
【学位单位】：河北农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：TS201.3
【文章目录】：
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英文摘要
引言
    1 国内外研究现状
        1.1 单增李斯特菌的生物学特征
        1.2 单增李斯特菌的传染与危害
        1.3 单增李斯特菌的检测方法研究
            1.3.1 传统的分离鉴定方法
            1.3.2 基于免疫学检测方法
            1.3.3 分子生物学检测方法
        1.4 单增李斯特菌的分型方法研究
        1.5 单增李斯特菌的毒理机制研究
            1.5.1 粘附侵袭相关毒力因子
            1.5.2 细胞内感染相关毒力因子
            1.5.3 毒力调控因子
            1.5.4 环境耐受因子
    2 研究目和意义以及研究内容
        2.1 目的意义
        2.2 研究内容
            2.2.1 保定、石家庄地区食源性单增李斯特菌的污染水平调查
            2.2.2 食源性单增李斯特菌的遗传多样性的RAPD分析
            2.2.3 食源性单增李斯特菌的毒理机制研究
        2.3 本研究技术路线
第一章 食源性单核增生性李斯特氏菌的食品污染调查
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
            1.1.1 标准菌株
            1.1.2 试验样品
            1.1.3 试剂及耗材
            1.1.4 主要仪器
        1.2 试验方法
            1.2.1 单增李斯特菌分离鉴定方法
            1.2.2 单增李斯特菌分离多重PCR验证方法
            1.2.3 单增李斯特菌基因组DNA的提取
            1.2.4 引物合成
            1.2.5 PCR反应条件
    2 结果与分析
        2.1 单增李斯特菌分离鉴定
            2.1.1 形态鉴定结果
            2.1.2 生化鉴定结果
            2.1.3 多重PCR鉴定结果
        2.2 单增李斯特菌分离株的来源及分布
    3 小结
第二章 食源性单核增生性李斯特氏菌遗传多样性的RAPD分析
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
        1.2 试验方法
            1.2.1 随机引物设计及选择
            1.2.2 DNA提取
            1.2.3 RAPD优化的反应条件
            1.2.4 RAPD扩增产物条带统计及数据处理
    2 结果与分析
        2.1 食源性单增李斯特菌RAPD扩增结果
        2.2 308 株单增李斯特菌株的聚类分析
        2.3 RAPD-PCR的重复性
    3 讨论
    4 小结
第三章 食源性单核增生性李斯特氏菌的毒理机制研究
    第一节 食源性单增李斯特菌主要毒力基因的PCR检测及分布研究
        1 材料与方法
            1.1 试验材料
            1.2 试验方法
                1.2.1 单增李斯特菌的活化及培养
                1.2.2 单增李斯特菌基因组DNA的提取
                1.2.3 毒力基因的引物设计与合成
                1.2.4 PCR反应条件
                1.2.5 PCR产物回收、测序及同源性比对
        2 结果与分析
            2.1 二十七个毒力基因引物特异性验证
            2.2 食源性单增李斯特菌毒力基因的PCR检测
                2.2.1 iap基因的PCR检测（扩增片段为 528 bp）
                2.2.2 inl（内化素）基因家族（又称为LIPI-2 毒力岛）的PCR检测
                2.2.3 第一毒力岛（LIPI-1）基因的PCR检测
                2.2.4 ami基因的PCR检测（扩增片段大小为 241 bp）
                2.2.5 fbp基因的PCR检测（扩增片段大小为 471 bp）
                2.2.6 hpt基因的PCR检测（扩增片段大小为 575 bp）
                2.2.7 bsh基因的PCR检测（扩增片段大小为 340bp）
                2.2.8 gadA基因的PCR检测（扩增片段大小为 544 bp）
                2.2.9 hfq基因的PCR检测（扩增片段大小为 207 bp）
                2.2.10 virR基因的PCR检测（扩增片段大小为 210 bp）
                2.2.11 mprF基因的PCR检测（扩增片段大小为 222 bp）
                2.2.12 dlt操纵子各基因的PCR鉴定（dltA、dltB、dltC、dltD的扩增片段长度分别为 277bp、                286bp、113bp、287bp）
                2.2.13 PCR产物序列测定及同源性比较
            2.3 27 个毒力基因在不同食品源单增李斯特菌中的分布
            2.4 27 个毒力基因在不同基因聚类的单增李斯特菌中的分布
        3 讨论
        4 小结
    第二节 食源性单增李斯特菌Lm319 主要毒力基因的时序性表达研究
        1 材料和方法
            1.1 试验材料
            1.2 试验方法
                1.2.1 单增李斯特菌的活化及培养
                1.2.2 单增李斯特菌基因组DNA的提取
                1.2.3 单增李斯特菌基因组RNA的提取
                1.2.4 毒力基因的引物设计与合成
                1.2.5 PCR反应条件
                1.2.6 cDNA第一条链合成
                1.2.7 RT-qPCR反应
                1.2.8 数据处理
        2 结果与分析
            2.1 单增李斯特菌Lm319 生长曲线测定
            2.2 单增李斯特菌Lm319 中毒力基因的PCR检测
            2.3 单增李斯特菌Lm319 毒力基因时序性表达的定性检测
            2.4 单增李斯特菌Lm319 毒力基因时序性表达的实时定量测定
        3 讨论
        4 小结
    第三节 食源性单增李斯特菌Lm319 的毒力基因在四种肉汤培养基中表达分析
        1 材料和方法
            1.1 实验材料
            1.2 试验方法
                1.2.1 单增李斯特菌的活化
                1.2.2 四种肉汤培养基制作
                1.2.3 四种肉汤培养基中单增李斯特菌的培养
                1.2.4 单增李斯特菌基因组DNA的提取
                1.2.5 单增李斯特菌基因组RNA的提取
                1.2.6 毒力基因的引物设计与合成
                1.2.7 cDNA第一条链合成
                1.2.8 PCR反应条件
                1.2.9 RT-qPCR反应
                1.2.10 数据处理
        2 结果与分析
            2.1 四种肉汤培养基中单增李斯特菌Lm319 毒力基因RT-PCR检测
            2.2 四种肉汤培养基中单增李斯特菌Lm319 毒力基因定量测定
        3 小结
    第四节 食源性单增李斯特菌的致病力研究
        1 材料和方法
            1.1 实验材料
            1.2 试验方法
        2 结果与分析
            2.1 试验小鼠的选择
            2.2 注射计量的选择
            2.3 不同基因聚类的单增李斯特菌致病力比较
            2.4 不同毒力基因对小鼠致病力影响
                2.4.1 inlA基因对小鼠致病力影响
                2.4.2 plcA，actA和plcB基因对小鼠致病力影响
                2.4.3 prfA基因对小鼠致病力影响
                2.4.4 hlyA基因对小鼠致病力影响
                2.4.5 virR，dltA和dltD基因对小鼠致病力影响
        3 讨论
        4 小结
结论与展望
    1 全文结论
    2 展望
附件一：毒力基因的序列测定结果
附件二：毒力基因的检测结果统计表
参考文献
在读期间发表的学术论文
作者简介
致谢

【参考文献】

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