马克斯克鲁维酵母的木糖代谢和工程改造以及绿脓杆菌Rh1I蛋白的定向进化

发布时间：2020-10-30 20:29

　　 本课题主要进行了两部分内容的研究。 1.马克思克鲁维酵母木糖代谢工程改造研究 利用微生物转化半纤维素生产清洁可再生能源乙醇一直是生物能源研究领域的热点之一,但是自然界中并没有可以直接高效转化半纤维素的微生物菌株。近年来诸多研究利用遗传工程对酿酒酵母和其他酵母菌株进行遗传改造以期得到高效发酵木糖的菌株,其难点在于酵母对五碳糖,尤其木糖的发酵能力不强。在酵母的木糖代谢路径中,木糖经木糖还原酶形成木糖醇,随后经木糖醇脱氢酶将木糖醇转换为木酮糖,进一步代谢,最终得到乙醇。研究不同菌株木糖代谢路径中的相关酶,是进一步研究生物转化可再生能源等相关问题的基础。 马克斯克克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)具有可以和酿酒酵母相媲美的利用葡萄糖发酵的能力,又有酿酒酵母所不具备的木糖利用及发酵的能力,因此,在发酵木糖工程菌的改造方面具有较大潜力,但是其发酵木糖能力较低。探索马克思克鲁维酵母发酵木糖的限制性因素是对其改造利用的重要环节。本研究主要通过克隆马克思克鲁维酵母木糖还原酶基因Kmxyll,初步研究木糖还原酶的基本性质,并分析其发酵木糖能力低的可能原因。根据木糖还原酶氨基酸序列中的保守部分结合TAIL-PCR方法,首次克隆得到马克思克鲁维酵母木糖还原酶基因Xyl1,并测序验证。在大肠杆菌中重组表达木糖还原酶蛋白并且对其进行一系列的性质测定,阐明马克思克鲁维酵母来源的木糖还原酶的基本性质。马克思克鲁维酵母来源的木糖还原酶的最适辅酶是NADPH,对NADH则没有活力。因此,木糖还原酶对NADPH的偏好性可能造成马克思克鲁维酵母在利用木糖的代谢途径中还原力不平衡,从而导致其对木糖的发酵能力低。为了进一步验证克隆的木糖还原酶的正确性,我们构建了木糖还原酶基因的敲除菌株YZB001,证明了木糖还原酶基因缺失的马克思克鲁维酵母不能利用木糖生长。为了改善马克思克鲁维酵母在高温下发酵木糖生产乙醇的能力,将毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis NBRC10063)来源的木糖还原酶(PsXR)及其突变体PsXRN272D和PsXRK21A/N272D转化进YZB001菌株中。改造后的菌株能大幅提高马克思克鲁维酵母在高温下利用木糖发酵生产乙醇的能力,其中PsXRN272D突变体效果最好。同野生型的马克思克鲁维酵母相比,重组马克思克鲁维酵母菌株YZB013(PsXR)和YZB014(PsXRN272D)同对照菌株YHJ010相比,在42℃时用20g/L木糖发酵分别提高了3.63倍和11.83倍的乙醇产量达到1.10g/L和3.55g/L乙醇。当温度上升到45℃时,YZB014菌株能发酵20g/L的木糖产生2.27g/L的乙醇。在以玉米芯酸水解液为发酵原料在42℃发酵时,YZB014菌株可以产生4.09g/L乙醇。重组马克思克鲁维菌株展现了其在利用生物质生产生物乙醇的潜力。 2.绿脓杆菌群体响应系统Rhll蛋白的定向进化 随着具有抗药性的细菌的出现,开发新型抗菌药成为一个迫切的任务。抑制群体响应是控制细菌感染的一个有效的途径,同时,群体响应抑制药物具有不易引起细菌抗药性的优点。开发这类高效药物需要对群体响应的LuxI同源蛋白及其与底物的相互作用的分子机制有清晰的理解。本研究的目标是通过改造LuxI同源酶RhlI的底物特异性来取得LuxI同源酶与底物相互作用分子机制的详细信息,从而为设计高效抑制绿脓杆菌群体响应系统中RhlI酶的新型抗生素药物,提供充分而必要的信息。为实现该目标,本研究改造RhlI酶的底物特异性。设计了各种强度的筛选系统,利用定向演化,通过改造RhlI使其能够合成OHHL。通过设计一个绿色荧光蛋白作为信号输出的筛选和半定量系统,在第一轮的筛选过程中,通过三次筛选,筛选到了荧光值比出发蛋白分别提高了80.02%,167.45%和170.59%的突变体M8,S7和2M26。在此基础上,构建了第二轮的筛选系统,筛选到了突变体4M1产生信号分子激活荧光蛋白的能力比2M26提高了20.27%。这样通过改变RhlI的底物特异性,我们对于RhlI催化的分子机理就会有一个清晰的理解,为开发抑制群体响应药物提供有用而必要的信息。
【学位单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q93
【部分图文】：

XR-RS1、XR-RS2、XR-RS3。克隆出的序列经过测序确认。克隆出的KmxyU基因的氨基酸序列比对结果见图1.2，克隆出的基因序列及分析见图1.4。CS7 0 CO=iill 11^ ilil^JinliKm-xR n | _ M I 【■作■？5-XR 67 P I |y<GD?J~Te-XR 69 - ] r、] [: [ 1 ICt-XR 7.1 M 1 ftS'- ^ m 1 1 ,,ONN—Kl-XR 71 譽-I B _、SB W I IKEDEAKt-xR '11 '、屋‘‘BwB TpjPP"'-?I^K'S S 1 ■^^AEDEKKm-XP 141 KE1 ISEli:l|l#H^8HdBi:i::|l.Ei0^^4^KS^?-E3' Z! inVlfiL 2 1Ps->;R 136 …邏K暴孺^ 工、I ‘T?~XR 137 |. iCt-XR 140 ---FVyIiJ P f 2■宏參醫‘ §、Ki-xR i4i kghieJcJ Sj S llgTOii-1… V gj^7Km—XR 211 AOK'v^fc vMfflHl|HfcNEK L暴.:参 i:醒丨 S M ■ ^K-Ps-XR 203 AQSRfc lMSG|A、TS-XR 204 VQKsjfc KDBFI^pH^Hsfcp | ^ SCt-XR 207 AQK^Ht r^^^K^^BNOGR LHlpT^E^lMWgMJ | m ■K:I -XR 211 vKNftft W ^ |^B'Kt-XB 21) cKocjP^v■琴Pj^^PD.3。rJjks{ki:^^!ii^(K:J — ^ ^oKm-XR 231 KKESBE :...AETFT SDE IKF： NO DQG| 耶r|7_TFs-XR 273 TVfH' ^ tJn-SFD DEQ FAD a ".1 I |"K—t|t,|VTe-XR 2'M NPllvj :暴-秘1) TE.^ S? NKuf ^^?'S|GI.:Y-I|I|ACt-XH 27 7 LPH^hc RSFK-TFLj IKE FEE AK DT'J LjoM - - l|l|vKI-XR 231 KKK^pr： '.KfeDALT XDH LKQ SG MOMI ||ByL"ll.,DNE FITIJKt-KS 2B1 :.Q^EKI.T『‘：~ IBB ：.规图1.2不同酵母来源木糖还原酶的序列比对注：下划线表示兼并引物设计的区域，活性位点(0),底物结合基团（?)，辅酶结合区域(▽)分别标识出来，方框显示的是 ne-Pro-Lys-Ser 模体。A^wXR

Kmxyll同源区域内的扩增条带

第1章马克思克鲁维酵母的木糖代谢及其工程改造的研究激转化的方法将表达质粒转入大肠打菌中，然后诱导蛋白表达。如图1.5所示，用已经成功克隆的Kmxyll基因，设计引物XR-NDE和XR-HIND并马克思克鲁维酵母的基因组DNA为模版进行PCR反应扩增出目的条带，同质粒一起酶切并检测。5 kb3 kb 命2kb : “ "'Vtf*-, ?5* ? ** ??" *i kb . I ?750 bp500隱M 1 2图1. 5质粒pET21和Kmxyll基因的扩增条带酶切结果注：M: DL2000 plus II DNA marker： 1： pET21 条带；2: Kmxyll 基因条带载体和插入片段回收后连接并热激转化进入大肠杆菌。长出的克隆用菌落PCR检测以初步判断连接成功与否。5 kb|P* ^ISSB 3 kbp 2 kbflHBBRHH. WfeUi.lit'wuKi''-- 〔-MHSSSaBKmiMMBM '-<1 2 3 4 5 6 7 8 M图1. 6菌落PCR检测质粒pET21和KmxyU的连接情况注：M: DL2000 plus II DNA marker： 1-8：阳性克隆构建好表达载体后，转入到表达菌株E C0//BL21 (DE3)中，进行最优表达条件的摸索。接种表达菌株于5 mLLB培养基中，37°C培养过夜，第二天接种1%体积的菌种至7管新的LB中
【共引文献】

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本文编号：2862969