沙门氏菌的噬菌体试验性治疗及噬菌体抗性机制研究

发布时间：2020-11-02 23:31

　　 沙门氏菌是一种危害公众健康的重要病原体,能引起人和动物食物中毒和急性肠道疾病。随着沙门氏菌耐药性增强和耐药谱的变广,通过抗生素来预防和治疗沙门氏菌感染越发困难。据此,我们建立口服沙门氏菌的小鼠感染模型;对噬菌体对沙门氏菌小鼠感染模型的治疗效果进行评估;并对沙门氏菌对噬菌体的抗性机制进行了深入研究。为研究沙门氏菌QH的遗传进化特点和致病性,对沙门氏菌QH的全基因组进行了比较分析和小鼠感染模型建立。与其他沙门氏菌相比,沙门氏菌QH基因组含有较多的前噬菌体和基因岛,其核苷酸和同义密码子的使用模式表明突变压力和自然选择在基因水平上影响了沙门氏菌QH的进化趋势,而其独特的密码子使用模式有助于增强其对环境的适应性和对宿主的致病性。在沙门氏菌QH的感染早期,小鼠外周血中CD4+和CD8+淋巴细胞亚群的水平显著降低,但一些细胞因子(IFN-β1,IFN-γ和CXCL10)转录水平的升高可能在抗沙门氏菌感染中具有多种免疫效应。此外,小鼠外周血中IL10的转录和翻译水平显著升高,表明IL10介导的免疫抑制作用可能在口服沙门氏菌QH感染的早期起了重要作用。从国内不同地理位置分离了4株烈性沙门氏菌噬菌体,发现它们都属于肌尾科并具有相似的生物学特性,与另外2株国内的和2株智利的噬菌体具有相似的进化模式。基于4株噬菌体基因组中AT含量GC含量的背景,通过信息熵分析表明整体核苷酸使用偏好是由噬菌体所有的基因决定的。密码子不同位置核苷酸的使用偏好性要比所有基因的整体核苷酸使用偏好性强(p0.001),而这种遗传特性直接导致了同义密码子倾向于A/T结尾。而噬菌体核苷酸组成约束和自然选择迫使噬菌体在整体密码子使用模式方面具有相同的进化趋势。核苷酸组成约束也在噬菌体同义密码子使用模式形成过程中起重要作用,包括码子第1位的keto skew、第2位的嘧啶skew和第3位的AT skew。噬菌体SP1对沙门氏菌QH的吸附速度快,裂解效率高。然而,噬菌体SP1对小鼠感染模型的治疗效果不好,虽然通过口服噬菌体SP1一定程度上缓解了小鼠的临床症状,但在持续的给药治疗过程中,小鼠的脾脏载菌量依然达到3.1×10~5 cfu/mL,我们推测噬菌体治疗时间较晚和沙门氏菌QH对噬菌体SP1产生抗性是可能主要原因。我们从沙门氏菌QH中筛选出一株对噬菌体SP1耐受的突变株QHM,噬菌体SP1无法吸附在突变株QHM的表面。沙门氏菌QH脂多糖是噬菌体SP1受体,突变株QHM基因组上与脂多糖合成相关的rfaJ基因721bp处的碱基从G突变为T,造成了编码谷氨酸的密码子GAG突变为终止密码子TAG,从而使得糖基转移酶的合成失败,最终使得突变株QHM的脂多糖结构不完整。为进一步验证rfaJ基因的功能,我们构建了缺失株QHΔrfaJ发现,rfaJ基因敲除后会造成脂多糖结构不完整,噬菌体SP1无法吸附和感染缺失株QHΔrfaJ。最后,通过分析沙门氏菌QH、突变株QHM和噬菌体SP1之间的生长关系和波动实验,我们发现,这种抗性机制是通过自然突变产生,与噬菌体SP1无关。本实验对沙门氏菌QH及其噬菌体的生物学特性和遗传进化关系进行了全面系统的研究;并通过小鼠感染模型及噬菌体治疗实验,对食源性沙门氏菌感染小鼠后引起的免疫应答反应和噬菌体的治疗效果进行了系统的评估;同时,对沙门氏菌对噬菌体的抗性机制进行了深入的研究。为沙门氏菌感染后的噬菌体治疗和抗性机制的研究提供了理论依据。
【学位单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

噬菌体SP1与沙门氏菌QH混合作用1 min时,噬菌体SP1开始向沙门氏菌QH聚集,少量的噬菌体SP1吸附沙门氏菌QH表面(图3-1a);5 min时,大量的噬菌体SP1吸附和包围在沙门氏菌QH表面(图3-1b);10 min时,沙门氏菌QH被裂解,并释放子代噬菌体SP1(图3-1c)。结果表明,噬菌体SP1能够快速的吸附在沙门氏菌QH表面,并且在短时间就能裂解沙门氏菌QH。2.1.2 噬菌体SP1对沙门氏菌QH的裂解效率

在小鼠口服噬菌体3日,对每只小鼠的外周血淋巴细胞亚群进行定量测定发现,与Phage组和Mock组相比,QH组和Treatment组小鼠的外周血中的CD4+细胞亚群有明显的下降趋势(图3-2a);同样,QH组和Treatment组小鼠的外周血中CD8+细胞亚群也有明显的下降趋势(图3-2b)。2.2.2 小鼠脾脏中细胞因子转录水平的变化

通过qRT-PCR测定各组小鼠的细胞因子转录水平发现:QH组和Treatment组与Phage组和Mock组相比,3种IFN转录水平变化有差异,其中QH组和Treatment组小鼠的IFN-β1和IFN-γ的转录水平均显著升高,而IFN-λ2转录水平显著降低(图3-3a);此外IL-10和CXCL10的转录水平也明显升高(图3-3b)。2.2.3 小鼠外周血中细胞因子表达水平的变化
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本文编号：2867746