金属胁迫下中华稻蝗金属硫蛋白分子特性及功能研究

发布时间：2020-11-04 11:56

　　 快速发展的工业化和城市化导致重金属的污染日益严重,这关系到人类健康和环境安全。被重金属污染的土壤和水体可通过农业灌溉进入食物链并转移到植物和动物体内。水稻是我国种植面积最广的粮食作物,稻田是目前重金属污染最为严重的农业区域。金属硫蛋白(Metallothionein MT),是一类金属结合蛋白。自1957年首次在马肾中发现以来,研究者们陆续在不同生物类群中展开了对MT的研究,所涉及的领域包括生命科学、物理化学、应用医学和环境监测等。MT是细胞内一类低分子量、高半胱氨酸含量的蛋白分子,对具有10个电子的金属具有极高的亲和力,包括必需金属(锌和铜等)和非必需微量元素(镉和汞等)。MT普遍存在于微生物、植物、动物以及人类细胞中,在金属代谢中起着重要的作用。近年来,对昆虫MT的研究仅限于果蝇、土壤跳虫、蚊虫等少数物种,目前很少见对农业害虫MT分子特性及功能方面的系统研究。中华稻蝗(Oxya chinensis, O. chinensis)是以水稻叶片和茎杆为食的重要农业害虫,重金属可通过中华稻蝗取食富集重金属的水稻植株后在虫体内不同组织中蓄积。本文以重金属镉、铜和锌为胁迫诱导因子,研究重金属作用下中华稻蝗金属硫蛋白基因(Oxya chinensis Metallothionein, OcMT)的分子特性和功能以及对中华稻蝗解毒酶系和组织形态结构的影响。本文通过深入开展以上研究,对阐明中华稻蝗金属硫蛋白基因功能和重金属解毒机制具有重要意义。本文主要内容如下：1、中华稻蝗金属硫蛋白的分子特性分析基于中华稻蝗经重金属镉染毒后构建的数字基因表达谱,采用生物信息学方法系统分析得到2个OcMT基因(OcMT1和iOcMT2)的全长序列。已知OcMT1分子全长552 bp,开放阅读框为123 bp,编码40个氨基酸残基；OcMT2分子全长363 bp,开放阅读框为195 bp,编码64个氨基酸残基；将这2个MT基因序列与目前已知的其他昆虫MT序列进行比对和分析,发现OcMTl和OcMT2具有与其他物种MT蛋白类似的氨基酸特征,半胱氨酸(Cys)含量分别为22.5%和25%,这些半胱氨酸在氨基酸分子中以Cys-Cys, Cys-X-Cys, Cys-X-Y-Cys或Cys-X-Y-Z-Cys的结构式存在,这样的分子组成和特征使半胱氨酸的巯基容易与金属离子结合形成M-MT复合物。2、中华稻蝗金属硫蛋白基因mRNA转录特性分析采用RT-qPCR技术检测了金属硫蛋白基因在中华稻蝗不同发育阶段和不同组织部位RNA转录表达特性,结果表明：OcMT1和OcMT2均在中华稻蝗卵期转录水平最高,而在孵化后的整个发育时期稳定表达,且转录表达量较卵期低；OcMTl和OcMT2具有不同的组织分布,OcMT1在视叶中表达最高,而OcMT2在脑中高表达,其次是脂肪体,表明中华稻蝗2个OcMT基因在生理功能具有差异性。3、中华稻蝗金属硫蛋白基因和蛋白功能研究利用RNA干扰技术进一步从分子水平研究了OcMT1和Oc. MT2的功能,中华稻蝗注射双链RNA (dsRNA)48 h后,用不同浓度的3种金属处理试虫,结果表明：OcMT1和OcMT2 mRNA转录表达量在63.1-70.9%的有效沉默时,金属毒性导致试虫死亡率增加8.5-16.7%；异源表达OcMT1和OcMT2蛋白的大肠杆菌在含铜培养基的生长测试实验表明,OcMT1和OcMT2蛋白可增强宿主细菌对铜的耐受性；采用荧光光谱法检测OcM T1和OcMT2蛋白对不同金属的结合能力,结果表明,异源表达OcMT1和OcMT2蛋白均可螯合镉、铜和锌3种金属,且OcMT1与锌的结合能力最强,()cMT2与铜的结合能力最强。4、重金属对中华稻蝗解毒酶活性和组织形态的影响慢性镉染毒后中华稻蝗体内磷酸酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽硫转移酶等解毒酶活性普遍上升；镉毒性可导致中肠、胃盲囊、马氏管以及围食膜组织结构严重受损；慢性镉染毒后中华稻蝗不同类型血细胞形态和组成发生变化；中华稻蝗经镉、铜、锌急性染毒后,发现虫体脂肪体的脂肪滴直径变小；马氏管内均出现不同形态的颗粒物质。结果表明,中华稻蝗相关组织通过不同形式参与重金属的解毒,对降低重金属毒性,保护虫体发挥重要的作用。综上所述,本文通过对重金属胁迫下中华稻蝗金属硫蛋白基因、蛋白、组织形态和解毒酶变化等系列研究,揭示在重金属胁迫下虫体基因水平、蛋白水平以及组织学水平的适应性变化规律。研究结果对昆虫重金属解毒机制研究具有一定的理论意义,同时也为检测和评估农业环境中重金属的污染和危害提供实践依据。
【学位单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：X174;S435.112.4
【部分图文】：

１９５７年作为锡结合蛋白被Ｖａｌｌｅｅ和Ｍａｒｇｏｓｈｅｓ在马肾中发现由于其分子中富??半脫氨酸且容易与重金属离子结合，因此被命名为金属硫蛋白１４＼科学家陆续在??不同的物种中进行了大量的研究和探讨后发现其存在于细菌、植物、无脊椎动物和??脊椎动物等几乎所有的生物体内１ＷＷ。因其分子中含有较多数量的半腕氨酸残基，使??其分子有较高的硫含量且对重金属具有较高的亲和力。ＭＴ分子中所含有的半化氨酸??在绝大多数生物体ＭＴ中是高度保守的，这些半腕氨酸残基通常配位键形成??Ｃｙｓ－Ｘａａ－Ｃｙｓ的排列方式（Ｘａａ是除半脫氨酸Ｗ外的其他氨基酸），其中Ｘ和Ｙ多为??Ｓｅｒ或Ｔｈｒ，其次为Ａｒｇ和Ｌｙｓ。尽管金属硫蛋白具有一些共有的性质和特点，但来??自不同物种的ＭＴ蛋白质的大小和氨基酸组成差别很大，甚至同一物种的不同亚型??间其组成也不尽不同。目前研究最多且较为清楚的是人类ＭＴ，人类ＭＴ位于第１６??号染色体且分为４个类型（ｉＷ７，?和Ａ／７Ｖ），Ｍ７和在全身表达，??特异性的表达于脑，ｉｌ／风则只发现存在于复层鱗状上皮【＂１。??１．２．１金属硫蛋白的特点??

有样品中表达量最化的样品的表达量为１，其他各个样品的ｍＲＮＡ转录表达??１的倍数，用相对表达水平表征。所有实验结果分析后Ｗ平均数±标准误表示，??用Ｔｕｋｅｙ＇ｓ?ＨＳＤ法（ＳＰＳＳ）对实验结果进行分析。基因相对表达量柱形图上??不同字母代表基因表达具有显著性差异（尸＜化〇５），不同数据间没有显著性??用相同字母代表。??验结果??华稻惶金属硫蛋白基因的验证??研究在前期工作基础上，采用重金属領慢性染毒处理中华稻幢后，构建数字??达谱，分析差异基因表达情况。结果表明，領慢性染毒后有巧９个基因上调表??调表达基因有１８９个，其中２个ＯｃＭＴ基因分别上调表达２７９倍和４８３倍。初步分??个ＯｃＭＴ基因的转录上调可能与重金属領处理中华稻幢有关。将２个ＯｃＭＴ基因??Ａ序列输入Ｇｅｎｂａｎｋ数据库进行Ｂｌａｓｔ分析，并与其他已知昆虫ＭＴ氨基酸序列进??，初步判断２个基因可能为中华稻幢ＯｃＭＴ基因，因此进行了验证和分析。??Ｍａｒｋｅｒ??

ＡＥＯ５０６９９），?冈比亚按蚊：如０ｐ片ｅ／ｅ■ｓ各ｆｌ７Ｋ６／口ｅ（＾ｇＡ／７７：ＡＡＸ８６ＯＯ６，／＾各Ａ／７２：ＡＡＸ８６ＯＯ７），摇蚊：Ｃ／Ｈ＇ｒａＫ〇／Ｋｗ／＊ｚ）！Ｗ７７Ｍｓ??（ＯＭＴ：ＡＤ巧４１６３），姚妃：描６幻ｍｗｙ口ｏ（Ａｆ７７Ｗ：ＡＢＸ８００７８，Ａ／７７｝＾ＡＡＸ８６０Ｃｒ７９）。??由图２．４可见，中华稻幢２个ＭＴ氨基酸（ＯｃＭＴｌ和ＯｃＭＣ）与其他昆虫ＭＴ??的进化关系分析显示，ＯｃＭＴｌ与家蜗ＭＴ１?Ｗ及黒腹果禍ＭＴＡ聚为一支，而ＯｃＭＴ２??与此的ＭＴＴｙ２聚为另一支。??２．３．２中华稻幢金属硫蛋白基因序列的分析??将２个ＯｃＭＴ基因ｃＤＮＡ全长序列提交ＮＣＢＩ官方网站，并获得ＧｅｎＢａ址注释??号分别为：ＫＪ１５３０１４和ＫＪ１５３０１５。这２个ＯｃＭＴ基因具有完整结构，包括起始密??码子ＡＴＧ，终止密码子ＴＧＡ和ＰＩｏｙＡ尾（ＡＡＴＡＡＡ）。ＯｃＭ？７全长为５５２?ｂｐ，其开??放阅读框为１２３ｂｐ，编码４０个氨基酸，其蛋白的理论分子大小为３．７４?ＫＤａ，等电点??为?８．１１，分子中含有?１?个?Ｃｙｓ－Ｃｙｓ?三个?Ｃｙｓ－Ｘ－Ｃｙｓ?结构（ＣＣＸＸＸＸＸＣＸＸＸＸＣＫＣＸ??－ＸＸＣＴＣＴＮＣＡＣ）；?ＯＣＭＴ２全长为３６３?ｂｐ

本文编号：2870066