酿酒酵母中应激颗粒形成的相关基因及作用规律

发布时间：2020-11-09 17:23

　　 当真核细胞面临逆境条件时,细胞内会形成由m RNA结合且体积较大的细胞质颗粒物、核糖体元件和包括转录因子在内的RNA结合蛋白。在这些颗粒物形成的同时,细胞内的m RNA暂时保持沉默,使细胞的能量集中在转录与生存相关的蛋白。在逆境下因细胞转录中断而合成的颗粒物可以被降解,当环境条件得到改善时重新进行转录。在这些颗粒物中,有两种蛋白组分不同的RNA颗粒被区分开来:应激颗粒(Stress Granules),或称应力颗粒,及过程产物P小体(Processing Bodies)。其中P小体的体积较小,形状规则,常态时在细胞中亦有分布。应激颗粒是本课题主要的研究对象,它具有较大且不规则的形状,由不翻译的信使核糖核蛋白颗粒(messenger ribonucleo protein particle,m RNP)组成,其组装是由各种环境压力引发的,包括热激,碳匮乏,过氧化,高渗透压,病毒感染,紫外线照射等,但不包括X射线照射和DNA损伤剂逆境。形成RNA的细胞质颗粒的能力是细胞在压力下生存的重要条件,也是打破自身凋亡和生存之间平衡的重要条件。对应激颗粒形成相关基因及作用规律的研究,在对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)的应激能力提供了分子层面的解释的同时,对于其他真核细胞在逆境下的存亡选择依据和哺乳动物中癌细胞的形成机制也具有参考意义。至今,酿酒酵母(S.cerevisiae)中应激颗粒的具体成分、形成条件以及逆境激活信号通路的调控机制等问题尚不为人所知,说明上述机制正是本课题研究的目的。酿酒酵母(S.cerevisiae)的全基因组测序已完成,而自动化的合成遗传阵列(Synthetic Genetic Array,SGA)分析技术和基因组水平的高通量的成像筛选技术也已经研制成功。基于上述技术条件,本研究将带有红色荧光蛋白的应激颗粒标记物PAB1-RFP转化到酿酒酵母(S.cerevisiae)基因组中,再通过SGA的融合技术,对带有PAB1-RFP标记的4600株单基因敲除突变子和800株温度敏感型突变子进行应激颗粒的逆境诱导,主要以脱氧葡萄糖处理为逆境条件,基于应激颗粒丰度,筛选出与野生型差别较大的突变子,分析这些突变子缺失基因的功能与应激颗粒组装和分解之间的联系,以此探明细胞在应激颗粒形成过程中涉及的生物代谢途径。通过大规模筛选,发现了许多与应激颗粒形成相关的功能基因。经分析发现应激颗粒形成所需基因集中在:胞内体组分、核糖体组分、GARP复合物、EGO-GSE复合物和蛋白质折叠。而导致应激颗粒异常增多的缺失基因多与生物体膜结构、囊泡转运以及自噬作用相关,作用于应激颗粒的分解。大多数表型突出的阴性突变子在面临其他逆境条件时,如热激、高渗透压,仍然难以形成应激颗粒,但有一部分突变子的阴性表型是针对特定的逆境条件的。那些缺失后致使应激颗粒无法形成的蛋白,大多集中在低复杂度结构区域,说明很多非紧密结合的大分子与应激颗粒的结构完整性密切相关。热激能在诱导应激颗粒形成的同时提高芽殖酵母的突变频率,一些应激颗粒形成困难的突变子在热激中显示出更高的突变率,而这种特性仅存在于热激逆境下。筛选结果中的几个影响应激颗粒形成的突变会影响到Ran GTP酶和TOR代谢通路,调控RNA和蛋白质的核质运输。在应激颗粒形成困难的突变子中,逆境调控的信号蛋白的转录达到了极端的程度:逆境诱导的m RNA积累的比野生型更多,然而被逆境抑制的m RNA在这些突变子中也更为剧烈的减少。这些结果说明应激颗粒不仅被PKA,HOG等逆境信号通路所调控,并且它也能调节逆境反应的程度。据推断,RNA结合蛋白的往复的核质运动负责逆境中的基因表达调控,应激颗粒正是这种核质运动的调控者。逆境下应激颗粒组装能力强的细胞有生殖能力和适应能力更强的倾向。反之,应激颗粒的缺失可能导致逆境条件下细胞出现过度的有害反应。应激颗粒的组装可能是细胞对叠加逆境的应激反应减弱的原因之一。此外,本课题还对酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞在衰老过程中产生的损伤蛋白聚集体和应激颗粒进行了对比分析,首先观察到这两者之间并不存在共定位关系,进而发现细胞衰老可以诱导应激颗粒形成,而在其他逆境下衰老细胞应激颗粒的合成被抑制。与应激颗粒相似的是,非逆境条件下衰老细胞的蛋白聚集体丰度高于新生细胞,但逆境下新生细胞中的蛋白聚集体形成率高于衰老细胞,说明细胞衰老对逆境下的蛋白聚集体组装有抑制作用。
【学位单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q933
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 研究的目的和意义
    1.2 国内外研究综述
        1.2.1 酿酒酵母的合成遗传阵列技术
        1.2.2 RNA颗粒简介
    1.3 目前存在的主要问题
    1.4 本文的主要研究内容
第2章 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 培养基相关试剂
        2.1.3 实验主要试剂
        2.1.4 主要实验设备与用途
    2.2 实验方法
        2.2.1 质询菌株的构建
        2.2.2 构建PAB1-RFP单基因敲除阵列
        2.2.3 应激颗粒形成相关基因的大规模筛选
        2.2.4 筛选结果的验证
        2.2.5 缺失基因的补回验证
        2.2.6 荧光显微镜成像
        2.2.7 遗传图谱的构建
        2.2.8 生物信息学分析
        2.2.9 酵母恢复生长曲线
        2.2.10 逆境后细胞存活率的测量
        2.2.11 CAN1基因突变频率的测定
        2.2.12 应激性信号蛋白和基因表达水平定量分析
        2.2.13 Western杂交
        2.2.14 酵母菌滴测试
        2.2.15 酿酒酵母世代数的测定
        2.2.16 衰老细胞的分离纯化
        2.2.17 细胞壁芽痕染色
        2.2.18 多聚核糖体含量分析
第3章 应激颗粒形成相关基因的大规模筛选
    3.1 引言
    3.2 荧光标记应激颗粒组成蛋白PAB1
        3.2.1 应激颗粒组成蛋白Pab1
        3.2.2 PAB1-RFP质询菌株的构建
        3.2.3 PAB1-RFP在酿酒酵母细胞中的表型
    3.3 标记菌株与酿酒酵母基因组单敲除文库的融合
    3.4 应激颗粒表型的评价和最适诱导条件的摸索
        3.4.1 应激颗粒表型的评价方法
        3.4.2 大规模筛选实验条件探索
    3.5 基于应激颗粒表型的大规模筛选结果
        3.5.1 应激颗粒的候选阳性与阴性突变子
        3.5.2 候选突变子的检验
    3.6 本章小结
第4章 应激颗粒形成相关基因的代谢功能分析
    4.1 引言
    4.2 促进应激颗粒形成的基因功能分布概况
    4.3 转录翻译和RNA代谢对应激颗粒的影响
    4.4 蛋白结构域对应激颗粒的影响
    4.5 细胞中的膜结构对应激颗粒的影响
    4.6 细胞转运作用对应激颗粒的影响
    4.7 本章小结
第5章 应激颗粒对酿酒酵母的生理影响及作用规律
    5.1 引言
    5.2 不同逆境对应激颗粒与DNA突变率的影响
        5.2.1 不同逆境引发不同的应激颗粒发生率
        5.2.2 逆境下应激颗粒阴性突变子的DNA突变率变化
    5.3 应激颗粒阴性突变子中的信号蛋白表达变化
    5.4 应激颗粒与细胞衰老
        5.4.1 应激颗粒阴性突变子的世代寿命
        5.4.2 衰老细胞中的应激颗粒表型
        5.4.3 RNA颗粒与损伤蛋白聚集体
    5.5 RNA颗粒的形成机理
        5.5.1 mRNP去向决定m RNA命运
        5.5.2 逆境的启动和终止
    5.6 本章小结
结论
参考文献
攻读博士学位期间发表的论文及其它成果
致谢
个人简历

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本文编号：2876742