DNA链替换驱动的球形核酸组装及DNA键盘锁

发布时间：2020-11-13 19:01

　　 DNA作为一种由A、T、G、C四种脱氧核苷酸组成的生物大分子,是生物体内储存和传递遗传信息的基因载体,在生物体的生长、发育和遗传过程中起到了至关重要的作用。四种脱氧核苷酸之间遵循经典的Watson-Crick碱基互补配对原则,即A-T和C-G。由此,在DNA纳米技术领域,DNA成为一种结构可控且稳健的纳米构建材料,依赖其独特的可编程性、序列特异性和多样性,被广泛应用于大尺寸自组装纳米结构、动态DNA纳米器件及具备高信号放大能力的DNA级联体系等。基于toehold介导的DNA链替换原则,DNA分子机器在生物传感、逻辑运算及疾病诊断与治疗等方面展现出突出的应用潜力。金纳米颗粒作为一种功能性纳米材料,由于其独特的物理化学性质,优异的稳定性和生物相容性而受到广泛关注。上世纪九十年代,Mirkin课题组首次报道了 DNA功能化的金纳米颗粒,命名为球形核酸。作为一种功能化的多元共价DNA-金纳米颗粒双层复合物,球形核酸同时具备金纳米颗粒内核和寡核苷酸外壳的优异特性,被广泛应用于体内外诊断、细胞成像、核酸比色检测、药物输送和超晶格结构组装等领域。本论文中,通过结合熵驱动的DNA催化网络,我们首先构建出一种灵活且肉眼可见的球形核酸聚集体解组装策略。相比于传统的直接连接策略,该整合的解组装策略分为上游的DNA催化网络部分和下游的SNA聚集体解组装部分,上下游体系利用一条引发链作为连接桥梁。在催化链(disassembler)诱导的连续toehold介导的链替换过程中,引发链逐渐从上游DNA催化网络中释放并启动下游球形核酸聚集体的解组装,通过肉眼观察上清液的颜色变化就可实现简便的目标链检测。该催化解组装策略可在较短的时间内达到低可视检测线,体系灵敏度高。在单核苷酸多态性区分应用上也展现出突出的序列选择性和竞争性,既能清晰地区分正确目标链和突变目标链,也能在高浓度突变目标链的干扰下成功检测出低量的正确目标链。此外,下游球形核酸聚集体的制备仅仅需要一种球形核酸单体和行使连接作用的自互补DNA双链参与,在室温条件下就可直接完成自组装过程;而且无需改变任何下游球形核酸聚集体结构就可与任意上游DNA催化网络相结合以实现特异性检测不同的目标链,以此构建出双输入“或”逻辑门,展现了在多组分检测应用上的灵活性和通用性,从而在便携式DNA诊断试剂盒制造和临床实时检测领域显现出潜在的应用价值。DNA键盘锁作为一种智能逻辑器件,与实现密码安全的顺序逻辑相结合,只能在正确的输入排列条件下才能完成逻辑运算,在分子层面上达到信息保护的需求。在第三章的研究中,通过利用可扩展的DNA组合底物作为“正确运行组件”和一系列相应的DNA双链消除器作为“错误消除组件”分别对正确和错误顺序的DNA输入链进行处理,我们构建了 一种纯DNA组分的均相键盘锁策略,只有正确顺序的输入链才能实现解锁操作。在对上述两种组分的结构和动力学竞争性分别优化后,双输入、三输入和四输入均相DNA键盘锁装置依次得以构建,并展现出优异的安全性能。相比于传统的键盘锁策略都需要借助异质固相平台来进行输入信息的分离或传感,该纯DNA组分的均相键盘锁体系利用了 DNA优异的可编程性和可扩展性,实现了多输入信息的一锅法分析,这将极大地简化操作复杂性,提高实验设计的灵活性,有利于推动更复杂信息安全体系的构建。自从Mirkin课题组利用热力学退火方式成功组装球形核酸形成不同晶型的超晶格结构后,这种经典的调节反应熵变的组装策略应用于晶体构建引起了广泛兴趣。在第四章的研究中,通过将金纳米颗粒表面的DNA walker动态行走策略与粘性末端诱导的球形核酸组装相结合,我们构建了单组分和双组分球形核酸聚集体,在室温条件下分别得到了面心立方(fcc)和CsCl晶体结构。首先,确保双足行走链在颗粒表面的动态行走过程能够满足高效的行走效率和稳定的行走持久性;其次,DNA walker诱导的球形核酸组装动力学结果表明合适的双足行走链浓度和连接链比例可以驱动聚集体形成;然后,采用热力学退火方式对不同种类粘性末端结合的无序聚集体进行构象调整,减少晶格缺陷,形成了规则排列的晶体结构;最终,不同浓度的双足行走链在金纳米颗粒表面的行走结果表明,当浓度较低时,粘性末端在颗粒表面能够实现缓慢结合,从而促使组装体系在每一步过程中均有足够的时间切换粘性末端的连接或释放,达到一系列接近平衡状态。随着颗粒间相互作用逐步增强,整体将达到自由能最低的稳态,从而得到面心立方(fcc)和CsCl晶体结构,这极大地推动了可编程胶体结晶在制备复杂且功能化纳米材料和实现复杂相行为的潜在发展。综上所述,基于toehold介导的DNA链替换反应,本论文利用多种DNA级联体系对球形核酸的组装和解组装进行精确调控,表明其适用于核酸检测、单核苷酸多态性区分、多输入逻辑门和超晶格结构组装,以及可扩展的DNA组合底物可实现纯DNA组分的多输入均相键盘锁体系构建,这些结果充分体现了实验策略的优势和突出的应用潜力。
【学位单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R318;TB383.1
【部分图文】：

?１?￣?ｈ??ｈ－ＳＮＡ?ｐ－ＳＮＡ??Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ??＼?／?Ｔｒｉｇｇｅｒ?７＾??ＳＮＡ＾ｆ＾?ｅ－?ｄ－?，?ｄ?ｆ??ｒ?１１?＜?１１１１１１１１１?ｍ?１１１１１１１?Ｉ－??＾?ｎ￣ｄ￣?ｐ－ｓｎａ??ｈ－ＳＮＡ??？?２．２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｔｒａｔｅｇｙ?ｆｏｒ?ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ＤＮＡ?ｃｉｒｃｕｉｔ?ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ?ｖｉｓｉｂｌｅ?ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ?ｏｆ?ＳＮＡ??ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ．??如图２．２所示，我们设计的ＳＮＡ聚集体解组装策略分为上游ｔｏｅｈｏｌｄ介导的??链替换反应驱动的ＤＮＡ催化网络部分和下游的ＳＮＡ聚集体解组装部分，上下??游两部分通过上游循环过程中释放的引发链ｔｒｉｇｇｅｒ相连，一旦引发链释放便会??引发下游ＳＮＡ聚集体的解组装。参照Ｍｉｒｋｉｎ课题组报道的面心立方（ｆａｃｅ－??ｃｅｎｔｅｒｅｄ?ｃｕｂｉｃ，?ｆｅｅ）晶体结构的实验策略［｜３５］，该ＳＮＡ聚集体解组装实验的下游??体系同样只有一种ＳＮＡ单体和一种ＤＮＡ双链复合物（ｄｕｐｌｅｘ?ｌｉｎｋｅｒ）参与，以??３２??

?Ｈ１－ＳＮＡ?Ｏｎｅ?ｓｔｅｐ??＃?Ｍｕ．ｔ，?ｓｔｅｐｓ??，一雜＾■書??１＊２＊３＊??Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ?二）ｋ．??／?Ｗ?３１Ｋ６１??＾Ｐ１?Ｉ〔Ｉ??Ｏｒｄｅｒｅｄ?Ｌａｔｔｉｃｅ?ｉｎｋｅｒ＇Ａ??图?４．２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｄｅｓｉｇｎ?ｏｆ?ａ?ｔｗｏ－ｌｅｇｇｅｄ?ＤＮＡ?ｗａｌｋｅｒ?ｄｒｉｖｅｎ?ｂｙ?ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ｈａｉｒｐｉｎ?ａｓｓｅｍｂｌｙ??ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ?ＳＮＡ?ａｓｓｅｍｂｌｙ．??如图４．２所示，借助催化发卡组装实验方法，我们在２０ｎｍ金纳米颗粒表面??设计了双足ＤＮＡ?ｗａｌｋｅｒ行走策略，通过逐步缓慢引入金纳米颗粒组装所必需的??粘性末端，驱动有序晶体形成。首先，通过发卡链Ｈ１与球形核酸表面修饰的ＤＭＡ??单链探针发生碱基互补杂交，在金纳米颗粒表面构建出发卡链ＨＩ固定的三维行??走轨道，即Ｈ１－ＳＮＡ。其次，双足行走链（ｔｗｏ－ｌｅｇｇｅｄｗａｌｋｅｒ）能够同时识别轨道??上两个相邻的发卡链Ｈ１上ｔｏｅｈｏｌｄ区域“丨”，在发生ｔｏｅｈｏｌｄ介导的链替换反应??后，分别打开两个发卡链Ｈ１，暴露出发卡链Ｈ１上新的ｔｏｅｈｏｌｄ区域“３＊”，此过??程会将双足行走链固定在金纳米颗粒表面。最后，发卡链Ｈ１上新裸露的ｔｏｅｈｏｌｄ??区域“３＊”会被另一条发卡链Ｈ２上的区域“３”特异性识别，再在链替换反应后??形成稳定的Ｈ１／Ｈ２复合物的同时释放出相邻轨道上双足行走链中的一足，另一??足仍然固定在金纳米颗粒表面行走轨道上。一方面，双足行走链中脱落的一足可??以继续与金纳米颗粒表面相邻的发卡链Ｈ１发生链替换反应，打开新的发卡链Ｈ
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本文编号：2882517