家蚕新突变体4龄幼虫致死基因的定位克隆及功能研究
发布时间：2020-12-12 09:44
家蚕是一种完全变态昆虫,幼虫期是其整个生活史中生长发育和储存能量的重要阶段,因此幼虫期致死对家蚕生命周期的影响无疑是巨大的,同时也会对养蚕生产造成严重的经济损失。4龄幼虫致死突变（lethal mutant in the fourth instar larvae,l-4i）是一种新的幼虫期致死的突变体,本研究在对l-4i突变体遗传分析的基础上,采用图位克隆技术对l-4i的突变基因进行了定位克隆,构建了遗传连锁图,采用q RT-PCR、RNAi、酶活测定和添食特异性抑制剂方法对突变基因进行表达分析和功能验证,证实了家蚕拓扑异构酶基因Bmtop的突变是导致l-4i突变体的主要原因,为进一步研究l-4i突变体致死的分子机制奠定了基础。主要研究成果如下:一、l-4i突变体的表型特征与遗传分析4龄幼虫致死突变（lethal mutant in the fourth instar larvae,l-4i）是在对家蚕品种P33的饲养过程中发现的一种新的幼虫期致死型突变体,其特征为l-4i突变体幼虫在3龄第2天就表现出体型较正常个体小,活力较差,生长发育缓慢的特征,3龄期延长约2天,4龄起蚕后极少进食...
【文章来源】：江苏科技大学江苏省
【文章页数】：95 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 致死突变
1.1.1 致死发生的原因
1.1.2 致死基因的分类
1.2 果蝇致死基因相关研究
1.2.1 果蝇温敏致死突变基因Pros（Pros261和Prosβ21）
1.2.2 Triplo-lethal基因座
1.2.3 果蝇拓扑异构酶
1.3 家蚕致死基因的相关研究
1.3.1 家蚕致死基因的相关研究
1.3.2 家蚕致死基因的实际应用
1.4 拓扑异构酶研究背景
1.4.1 拓扑异构酶的分类
1.4.2 拓扑异构酶的生物学功能
1.5 基因功能的研究方法概述
1.5.1 RNAi技术
1.5.2 基因组编辑技术
1.5.3 GAL4/UAS系统
1.6 研究目的和意义
1.7 主要研究内容和方法
第二章 家蚕4龄幼虫致死突变体l-4i的表型特征与遗传分析
2.1 实验材料
2.2 遗传分析方法
2.3 结果与分析
2.3.1 l-4i突变体的形状特征
2.3.2 l-4i突变体的遗传分析
2.4 讨论
第三章 家蚕4龄幼虫致死突变体l-4i突变基因的连锁及定位分析
3.1 材料与试剂
3.1.1 实验材料
3.1.2 主要仪器
3.1.3 主要试剂
3.1.4 常用试剂配制
3.2 主要的实验方法
3.2.1 家蚕基因组DNA的提取方法
3.2.2 PCR反应体系的构建
3.2.3 琼脂糖凝胶电泳
3.2.4 多态性标记的筛选、连锁分析
3.2.5 新SSR标记的筛选及l-4i基因的精细定位和绘制基因连锁图
3.3 实验结果
3.3.1 试验材料饲养情况
3.3.2 BC1F及BC1M个体的表型与基因型
3.3.3 家蚕l-4i突变基因所在连锁群的确定
3.3.4 与家蚕l-4i基因连锁的新的SSR标记
3.3.5 BC1M回交群体的基因型分析及l-4i基因遗传连锁图的构建
3.4 讨论
第四章 家蚕4龄幼虫致死突变体l-4i候选基因的筛选
4.1 实验材料与试剂
4.1.1 实验材料的准备
4.1.2 主要实验仪器
4.1.3 主要实验试剂
4.2 主要的实验方法
4.2.1 家蚕总RNA的提取
4.2.2 总RNA经DNase I处理
4.2.3 第一链cDNA合成
4.2.4 real-time PCR（RT-PCR）
4.2.5 DNA片段的回收
4.2.6 目的片段与pMD18-T载体连接
4.2.7 大肠杆菌感受态的制备：
4.2.8 质粒DNA转化及阳性克隆筛选
4.2.9 RNA interference （RNAi）
4.3 实验结果
4.3.1 半定量方法筛选候选基因
4.3.2 克隆测序方法筛选候选基因
4.3.3 RNA interference （RNAi）初步验证突变基因
4.3.4 家蚕拓扑异构酶基因（Bmtop）组织表达谱和龄期表达谱
4.4 讨论
第五章 候选基因的功能验证
5.1 实验材料与试剂
5.1.1 实验材料的准备
5.1.2 主要实验仪器
5.1.3 主要实验试剂
5.2 主要实验方法
5.2.1 拓扑异构酶抑制剂喜树碱（Camptothecin，CPT）添食实验
5.2.2 一步法提取家蚕活性总蛋白
5.2.3 DNA超螺旋解旋法测定拓扑异构酶酶活力
5.3 实验结果
5.3.1 CPT添食实验
5.3.2 拓扑异构酶酶活测定
5.4 讨论
结论
参考文献
博士期间学术论文发表情况
致谢
本文编号：2912311
【文章来源】：江苏科技大学江苏省
【文章页数】：95 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 致死突变
1.1.1 致死发生的原因
1.1.2 致死基因的分类
1.2 果蝇致死基因相关研究
1.2.1 果蝇温敏致死突变基因Pros（Pros261和Prosβ21）
1.2.2 Triplo-lethal基因座
1.2.3 果蝇拓扑异构酶
1.3 家蚕致死基因的相关研究
1.3.1 家蚕致死基因的相关研究
1.3.2 家蚕致死基因的实际应用
1.4 拓扑异构酶研究背景
1.4.1 拓扑异构酶的分类
1.4.2 拓扑异构酶的生物学功能
1.5 基因功能的研究方法概述
1.5.1 RNAi技术
1.5.2 基因组编辑技术
1.5.3 GAL4/UAS系统
1.6 研究目的和意义
1.7 主要研究内容和方法
第二章 家蚕4龄幼虫致死突变体l-4i的表型特征与遗传分析
2.1 实验材料
2.2 遗传分析方法
2.3 结果与分析
2.3.1 l-4i突变体的形状特征
2.3.2 l-4i突变体的遗传分析
2.4 讨论
第三章 家蚕4龄幼虫致死突变体l-4i突变基因的连锁及定位分析
3.1 材料与试剂
3.1.1 实验材料
3.1.2 主要仪器
3.1.3 主要试剂
3.1.4 常用试剂配制
3.2 主要的实验方法
3.2.1 家蚕基因组DNA的提取方法
3.2.2 PCR反应体系的构建
3.2.3 琼脂糖凝胶电泳
3.2.4 多态性标记的筛选、连锁分析
3.2.5 新SSR标记的筛选及l-4i基因的精细定位和绘制基因连锁图
3.3 实验结果
3.3.1 试验材料饲养情况
3.3.2 BC1F及BC1M个体的表型与基因型
3.3.3 家蚕l-4i突变基因所在连锁群的确定
3.3.4 与家蚕l-4i基因连锁的新的SSR标记
3.3.5 BC1M回交群体的基因型分析及l-4i基因遗传连锁图的构建
3.4 讨论
第四章 家蚕4龄幼虫致死突变体l-4i候选基因的筛选
4.1 实验材料与试剂
4.1.1 实验材料的准备
4.1.2 主要实验仪器
4.1.3 主要实验试剂
4.2 主要的实验方法
4.2.1 家蚕总RNA的提取
4.2.2 总RNA经DNase I处理
4.2.3 第一链cDNA合成
4.2.4 real-time PCR（RT-PCR）
4.2.5 DNA片段的回收
4.2.6 目的片段与pMD18-T载体连接
4.2.7 大肠杆菌感受态的制备：
4.2.8 质粒DNA转化及阳性克隆筛选
4.2.9 RNA interference （RNAi）
4.3 实验结果
4.3.1 半定量方法筛选候选基因
4.3.2 克隆测序方法筛选候选基因
4.3.3 RNA interference （RNAi）初步验证突变基因
4.3.4 家蚕拓扑异构酶基因（Bmtop）组织表达谱和龄期表达谱
4.4 讨论
第五章 候选基因的功能验证
5.1 实验材料与试剂
5.1.1 实验材料的准备
5.1.2 主要实验仪器
5.1.3 主要实验试剂
5.2 主要实验方法
5.2.1 拓扑异构酶抑制剂喜树碱（Camptothecin，CPT）添食实验
5.2.2 一步法提取家蚕活性总蛋白
5.2.3 DNA超螺旋解旋法测定拓扑异构酶酶活力
5.3 实验结果
5.3.1 CPT添食实验
5.3.2 拓扑异构酶酶活测定
5.4 讨论
结论
参考文献
博士期间学术论文发表情况
致谢
本文编号：2912311
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