重要泛素化蛋白质的化学半合成新策略研究
发布时间：2020-12-15 13:25
泛素化是真核生物体内一种普遍存在的蛋白质翻译后修饰形式,参与调控蛋白降解、信号转导、DNA损伤修饰等许多重要的生命活动过程,泛素修饰系统的紊乱与癌症、神经退行性疾病等许多重大疾病密切相关。深入研究蛋白质泛素化参与细胞功能调控的生物化学、生物物理学机制,对于人类生命奥秘的揭示、疾病的诊断及治疗都具有重大意义,而实现这一目标的一个重要需求便是获取结构、性质均一的泛素化蛋白样品及功能化泛素探针工具。蛋白质化学合成允许我们在原子水平精准地构筑目标蛋白,为获取各种泛素化蛋白及泛素工具分子提供了强大的技术平台,并且在揭秘泛素信号的研究过程中发挥着不可替代的关键性作用。本论文围绕泛素化蛋白的合成新技术开展了相关研究工作,希望借助功能化小分子连接臂协助的蛋白偶联反应,以重组表达的蛋白为原料,获取泛素修饰蛋白模拟物。在这里,我们结合了“半胱氨酸-胺乙基化反应“及“自然化学连接反应”,建立了半合成泛素修饰蛋白的新方法。具体工作如下:我们首先以泛素化组蛋白为合成目标,发展了一种半胱氨酸-氨乙基化反应协助的泛素化蛋白半合成新策略-CAACU策略。该策略的关键是通过半胱氨酸-氨乙基化反应将携带可移除辅基的β-氨...
【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：165 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．１?Ｆｍｏｃ固相多肽合成技术??此外，伴随着机械制造能力的提升以及人工智能技术的发展，如今固相多肽??化学合成可以在程序控制的自动化合成仪上进行，将多肽合成、自动化以及人工??
?第１章???酰基叠氮，该活性中间体在过量硫醇存在条件下可原位硫解为多肽硫酯，再通过??外加Ｎ－端为半胱氨酸多肽片段就可以直接进行自然化学连接反应（图１．３）。??，ｐｔ啤人ＮＨＮＨ２＋?Ｃｙｓ＿｜ｐ５調一?ｐ＿，Ｃｙｓ＿（ｐｅ＾??；Ａｃｔｉｖａｔｉｏｒｋ?ｎａｔｉｖｅ?ｃｈｅｍｉｃａｌ?ｌｉｇａｔｉｏｎ?ｆ?Ｌｉｇａｔｉｏｎ?；??；（ＮａＮ〇２，?Ｈ＋）＼?ｏｆ?ｐｅｐｔｉｄｅ?ｈｙｄｒａｚｉｄｅｓ?／Ｃｙｓ－ｆｐｅ＾ｉｉ??〇?／?ｏ??Ａ．．?ｉｎｓｉｔｕＴｈｉｏｌｙｓｉｓ?ｊ?，?Ｘ?＿??ｐｅｐｔｉｄｅ＾?Ｎ３?—￣￣－?ｐｅｐｔｉｄｅ－＾ＳＲ?：??ｋ?????ｉ??图１．３基于醜肼的自然化学连接（图片引自文献：ＡｃｃｏｕｎｔｓｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１３，??４６（１１）：?２４７５－８４．）??酰肼作为硫酯前体具有很好的稳定性，且通过传统的Ｆｍｏｃ－固相合成技术即??可高效制备，此外，还可通过对表达蛋白进行肼解的方式来制备蛋白酰肼片段用??于表达蛋白连接。目前，基于酰肼的自然化学连接策略己经成功用于合成多种具??有挑战性的目标蛋白，如：携带多种翻译后修饰的核小体０１、结晶纯多聚泛素??链［２４＼难溶性膜蛋白ｔ２５ｌ等，得到了国际同行的广泛认可。??１．２．４蛋白质半合成??结合多肽固相合成技术以及自然化学连接技术目前可以顺利地全合成由??２００个以内氨基酸残基组成的蛋白质，但对于尺寸更大的中大型蛋白质的合成仍??然存在挑战。目前蛋白质全合成获取的最大蛋白的尺寸仍不超过５００个氨基酸??［２６乜在这方面，蛋白质半合成则为获取尺寸更大的目标蛋白提供了有效方案。??
?第１章???蛋白片段。其中，Ｎ端为半胱氨酸的蛋白片段比较容易通过生物表达获得［３１１然??而重组表达蛋白硫酯片段则面临较大的困难，直到蛋白质剪切技术被发展。??蛋白剪接过程是生物体内普遍存在的一种自发的蛋白翻译后修饰过程，在体??内通过一种被称为内含肽（ｉｎｔｅｉｎ）的蛋白所介导发生。包含ｉｎｔｅｉｎ的前体蛋白通??过一系列精密的分子内重排，将两端的外显肽以酰胺键的形式连接，而ｉｎｔｅｉｎ则??在这一过程中被切除ｔＷ。这一过程的转化机制如图１．４所示，具体包括：１）内??含肽Ｎ端丝氨酸或半胱氨酸的侧链羟基或巯基亲核进攻Ｎ端外显肽的羰基，发??生Ｎ到０或Ｎ到Ｓ的酰基迁移；２）?Ｃ端外显肽首位丝氨酸或半胱氨酸的侧链??羟基或巯基亲核进攻第一步内含肽与Ｎ端外显肽形成的硫酯或氧酯中间体；３）??内含肽Ｃ末端天冬酰胺进攻内含肽与Ｃ端外显肽之间的酰胺键，形成琥珀酰亚??胺的五元环结构，释放内含肽以及Ｃ端外显肽的Ｎ端氨基；４）两个外显肽之间??发生Ｓ到Ｎ或０到Ｎ的酰基迁移，形成稳定的酰胺键。????＾?＾???？?？?Ｌ＾ＪｒＳ?＿?ｈ?？丫??????Ｈ?〇?Ｘ＇ＶＲ??，?Ｎ－Ｏ／Ｓ?Ａｃｙｌ?ｓｈｉｆｔ?ｌｎｌｅｉｎ?）??１?Ｎ．Ｅｘｔｅｉ”?１人ｉＨ?ｌｎｔｅｌｎ?ｌ￣Ｎ－?丨二?°?ｉ?＾?〇??＾?Ｌｉｎｅａｒ?（Ｔｈｉｏ）ｅｓｔｅｒ?Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ??ｘ＝?〇／ｓ?ｙ??Ｔｒａｎｓ（ｔｈｉｏ｝ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ??＾?ｖ＞。?Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ?ｈ???：—－?Ｈ?〇?／ｙ．???ｆｏｒｍａｔｉｏｎ?ｘ?０?ｘ、、Ｒ??＋?ｋ丄ｌｎｌ
【参考文献】：
期刊论文
[1]Semi-synthesis of disulfide-linked branched tri-ubiquitin mimics[J]. Yanyan Si,Lujun Liang,Shan Tang,Yunkun Qi,Yong Huang,Lei Liu. Science China(Chemistry). 2018(04)
本文编号：2918345
【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：165 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．１?Ｆｍｏｃ固相多肽合成技术??此外，伴随着机械制造能力的提升以及人工智能技术的发展，如今固相多肽??化学合成可以在程序控制的自动化合成仪上进行，将多肽合成、自动化以及人工??
?第１章???酰基叠氮，该活性中间体在过量硫醇存在条件下可原位硫解为多肽硫酯，再通过??外加Ｎ－端为半胱氨酸多肽片段就可以直接进行自然化学连接反应（图１．３）。??，ｐｔ啤人ＮＨＮＨ２＋?Ｃｙｓ＿｜ｐ５調一?ｐ＿，Ｃｙｓ＿（ｐｅ＾??；Ａｃｔｉｖａｔｉｏｒｋ?ｎａｔｉｖｅ?ｃｈｅｍｉｃａｌ?ｌｉｇａｔｉｏｎ?ｆ?Ｌｉｇａｔｉｏｎ?；??；（ＮａＮ〇２，?Ｈ＋）＼?ｏｆ?ｐｅｐｔｉｄｅ?ｈｙｄｒａｚｉｄｅｓ?／Ｃｙｓ－ｆｐｅ＾ｉｉ??〇?／?ｏ??Ａ．．?ｉｎｓｉｔｕＴｈｉｏｌｙｓｉｓ?ｊ?，?Ｘ?＿??ｐｅｐｔｉｄｅ＾?Ｎ３?—￣￣－?ｐｅｐｔｉｄｅ－＾ＳＲ?：??ｋ?????ｉ??图１．３基于醜肼的自然化学连接（图片引自文献：ＡｃｃｏｕｎｔｓｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１３，??４６（１１）：?２４７５－８４．）??酰肼作为硫酯前体具有很好的稳定性，且通过传统的Ｆｍｏｃ－固相合成技术即??可高效制备，此外，还可通过对表达蛋白进行肼解的方式来制备蛋白酰肼片段用??于表达蛋白连接。目前，基于酰肼的自然化学连接策略己经成功用于合成多种具??有挑战性的目标蛋白，如：携带多种翻译后修饰的核小体０１、结晶纯多聚泛素??链［２４＼难溶性膜蛋白ｔ２５ｌ等，得到了国际同行的广泛认可。??１．２．４蛋白质半合成??结合多肽固相合成技术以及自然化学连接技术目前可以顺利地全合成由??２００个以内氨基酸残基组成的蛋白质，但对于尺寸更大的中大型蛋白质的合成仍??然存在挑战。目前蛋白质全合成获取的最大蛋白的尺寸仍不超过５００个氨基酸??［２６乜在这方面，蛋白质半合成则为获取尺寸更大的目标蛋白提供了有效方案。??
?第１章???蛋白片段。其中，Ｎ端为半胱氨酸的蛋白片段比较容易通过生物表达获得［３１１然??而重组表达蛋白硫酯片段则面临较大的困难，直到蛋白质剪切技术被发展。??蛋白剪接过程是生物体内普遍存在的一种自发的蛋白翻译后修饰过程，在体??内通过一种被称为内含肽（ｉｎｔｅｉｎ）的蛋白所介导发生。包含ｉｎｔｅｉｎ的前体蛋白通??过一系列精密的分子内重排，将两端的外显肽以酰胺键的形式连接，而ｉｎｔｅｉｎ则??在这一过程中被切除ｔＷ。这一过程的转化机制如图１．４所示，具体包括：１）内??含肽Ｎ端丝氨酸或半胱氨酸的侧链羟基或巯基亲核进攻Ｎ端外显肽的羰基，发??生Ｎ到０或Ｎ到Ｓ的酰基迁移；２）?Ｃ端外显肽首位丝氨酸或半胱氨酸的侧链??羟基或巯基亲核进攻第一步内含肽与Ｎ端外显肽形成的硫酯或氧酯中间体；３）??内含肽Ｃ末端天冬酰胺进攻内含肽与Ｃ端外显肽之间的酰胺键，形成琥珀酰亚??胺的五元环结构，释放内含肽以及Ｃ端外显肽的Ｎ端氨基；４）两个外显肽之间??发生Ｓ到Ｎ或０到Ｎ的酰基迁移，形成稳定的酰胺键。????＾?＾???？?？?Ｌ＾ＪｒＳ?＿?ｈ?？丫??????Ｈ?〇?Ｘ＇ＶＲ??，?Ｎ－Ｏ／Ｓ?Ａｃｙｌ?ｓｈｉｆｔ?ｌｎｌｅｉｎ?）??１?Ｎ．Ｅｘｔｅｉ”?１人ｉＨ?ｌｎｔｅｌｎ?ｌ￣Ｎ－?丨二?°?ｉ?＾?〇??＾?Ｌｉｎｅａｒ?（Ｔｈｉｏ）ｅｓｔｅｒ?Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ??ｘ＝?〇／ｓ?ｙ??Ｔｒａｎｓ（ｔｈｉｏ｝ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ??＾?ｖ＞。?Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ?ｈ???：—－?Ｈ?〇?／ｙ．???ｆｏｒｍａｔｉｏｎ?ｘ?０?ｘ、、Ｒ??＋?ｋ丄ｌｎｌ
【参考文献】：
期刊论文
[1]Semi-synthesis of disulfide-linked branched tri-ubiquitin mimics[J]. Yanyan Si,Lujun Liang,Shan Tang,Yunkun Qi,Yong Huang,Lei Liu. Science China(Chemistry). 2018(04)
本文编号：2918345
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