斑马鱼卵黄原蛋白单/多克隆抗体的制备及其在环境雌激素检测中的应用

发布时间：2020-12-25 19:43

　　近年来,环境雌激素对野生动物生殖系统的危害受到了研究者的广泛关注,为了筛选出具有雌激素活性的化学物质,OECD与美国EPA建立了以鱼类为受试生物,以卵黄原（Vitellogenin, Vtg）为主要指标的筛选测试导则。斑马鱼（Danio rerio）是导则中推荐的重要模式鱼种之一,其Vtg的检测多采用导则中推荐的两种不同的酶联免疫吸附实验方法（ELISA）。Vtg诱导量的准确测定是正确评价化合物雌激素活性的重要前提,然而目前常用的测定方法和实验用鱼都可能会干扰Vtg的准确定量。为了确定高稳定性、高敏感性的斑马鱼Vtg ELISA检测方法,本研究对实验所用的抗原、抗体以及实验的方案、操作步骤进行了比较与优化;为了确定合适的实验用鱼,本研究检测了母源卵黄蛋白与新生成Vtg在斑马鱼发育过程中的变化情况,以寻找不含有Vtg的发育时期。此外,本研究还利用Octet生物分子相互作用系统建立了斑马鱼Vtg的生物传感器技术,为环境雌激素的筛选提供了简便、快捷的检测手段。本研究首先分离纯化了斑马鱼Vtg与卵黄脂磷蛋白（lipovitellin, Lv）,分析了它们的糖磷脂基团、分子量、氨基酸组成等基本性... 

【文章来源】：中国海洋大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：104 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
0 前言
1 抗体技术在环境雌激素检测中的应用研究进展
    1.1 鱼类卵黄原蛋白与卵黄蛋白的性质研究进展
        1.1.1 卵黄原蛋白的生成与酶解
        1.1.2 卵黄原蛋白与卵黄蛋白的免疫原性研究
        1.1.3 卵黄原蛋白与卵黄脂磷蛋白的生化性质比较
    1.2 抗体技术在卵黄原蛋白检测中的应用
        1.2.1 单向免疫扩散
        1.2.2 化学发光免疫
        1.2.3 放射性免疫
        1.2.4 免疫印迹
        1.2.5 酶联免疫吸附试验
        1.2.6 免疫胶体金技术
        1.2.7 免疫传感器技术
    1.3 研究展望
        1.3.1 建立准确定量Vtg的实验方案
        1.3.2 寻找高稳定性的标准品
        1.3.3 开发新型的生物标志物
        1.3.4 多种方法在Vtg检测中的联合应用
    1.4 研究目的和技术路线
2 斑马鱼Vtg ELISA建立、比较与斑马鱼Vtg空白期的确定
    2.1 材料与方法
        2.1.1 实验药品与仪器
        2.1.2 生物材料
        2.1.3 实验方法
        2.1.4 数据分析
    2.2 结果与分析
        2.2.1 卵黄原蛋白的纯化与鉴定
        2.2.2 抗血清效价的测定
        2.2.3 抗体的特异性
        2.2.4 抗体的纯化与鉴定
        2.2.5 斑马鱼Vtg两种ELISA的建立与比较
        2.2.6 卵黄蛋白与Vtg在发育过程中的变化
2暴露后斑马鱼幼鱼体内Vtg的含量测定">        2.2.7 E₂暴露后斑马鱼幼鱼体内Vtg的含量测定
    2.3 讨论
    2.4 小结
3 基于卵黄脂磷蛋白建立高稳定性的斑马鱼卵黄原蛋白夹心ELISA
    3.1 材料与方法
        3.1.1 实验药品与仪器
        3.1.2 生物材料
        3.1.3 实验方法
        3.1.4 数据分析
    3.2 结果与分析
        3.2.1 卵黄脂磷蛋白的性质鉴定
        3.2.2 抗血清效价的测定
        3.2.3 抗体的特异性分析
        3.2.4 夹心ELISA的建立
        3.2.5 久效磷对斑马鱼幼鱼Vtg的诱导
    3.3 讨论
    3.4 小结
4 基于卵黄脂磷蛋白单克隆抗体构建斑马鱼卵黄原蛋白夹心ELISA
    4.1 材料与方法
        4.1.1 实验药品与仪器
        4.1.2 生物材料
        4.1.3 实验方法
        4.1.4 数据分析
    4.2 结果与分析
        4.2.1 单克隆抗体的制备
        4.2.2 抗体的特异性检测
        4.2.3 抗体的鉴定
        4.2.4 夹心ELISA的建立
2暴露下斑马鱼幼鱼Vtg的含量测定">        4.2.5 E₂暴露下斑马鱼幼鱼Vtg的含量测定
    4.3 讨论
    4.4 小结
5 利用Octet生物分子相互作用系统建立斑马鱼卵黄原蛋白的快速检测方法
    5.1 材料与方法
        5.1.1 实验药品与仪器
        5.1.2 生物材料
        5.1.3 实验方法
        5.1.4 数据分析
    5.2 结果与分析
        5.2.1 标准曲线的建立
        5.2.2 样品中Vtg的测定
    5.3 讨论
    5.4 小结
6 结论与创新点
    6.1 结论
    6.2 创新点
参考文献
缩略词表
致谢
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已受理的发明专利


【参考文献】：
期刊论文
[1]Assessment of source water contamination by estrogenic disrupting compounds in China[J]. Weiwei Jiang1,Ye Yan1,Mei Ma1,Donghong Wang1,Qian Luo1,Zijian Wang1,Senthil Kumaran Satyanarayanan2 1.Research Center for Eco-Environmental Sciences,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100085,China. 2.Unit of Toxicology,Bharathiar University,Coimbatore 641046,India.  Journal of Environmental Sciences. 2012(02)
[2]瓦氏黄颡鱼卵黄脂磷蛋白(Lv)的纯化、性质鉴定及其抗血清的研制[J]. 李育培,刁晓明,盛晓洒,权恒,翟旭亮,李云.  水产学报. 2010(01)
[3]一种能原位检测类雌激素暴露的胶体金免疫检测试片[J]. 杨方星,徐盈.  生态毒理学报. 2007(02)
[4]美国红鱼卵黄原蛋白的分离纯化及电泳性质鉴定[J]. 李颖,汝少国,邴欣.  应用与环境生物学报. 2007(01)
[5]免疫传感器用于环境中痕量有害物质检测的研究进展[J]. 汤琳,曾光明,黄国和,牛承岗.  环境科学. 2004(04)
[6]兔抗甲胺磷多克隆抗体的制备[J]. 董国伟,王沫,刘贤进,余向阳.  华中农业大学学报. 2001(04)

博士论文
[1]金鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清制备及在内分泌扰乱化学物质检测中的应用[D]. 邴欣.中国海洋大学 2006



本文编号：2938277