p53及其异构体△133p53/△113p53在人类细胞和斑马鱼中的功能及生物学意义研究
发布时间：2021-01-09 20:13
抑癌因子p53在DNA损伤下被激活,抑制细胞周期或促进细胞凋亡,从而保证遗传物质的稳定性。但p53抑制DNA双链断裂修复,似乎与其抑癌的特性相矛盾。p53缺陷容易导致肿瘤发生,且p53缺陷的癌细胞对放疗化疗不敏感。大量证据显示p53可被各种胁迫激活并作出不同反应,甚至在同种信号下根据不同强度的刺激产生截然相反的作用,然而其中的分子机制仍有待研究。近年来已证明p53家族中存在着多种异构体p53,它们可以协同或拮抗p53调节下游信号通路,但对其功能和生物学意义的研究才刚刚开始。此外,p53可被高温激活,但它究竟起着怎样的作用还未曾报导。本论文从以下几个方面来探讨这些科学问题。1、我们发现△133p53/△113p53仅能被γ射线照射诱导表达,而不能被高温和UV照射诱导表达。进一步研究发现△133p53/△113p53能从转录水平上提高DNA双链断裂修复的关键基因表达,从而促进HR、SSA、NHEJ三种不同修复途径,它不仅能提高生物体在DNA双链断裂损伤下生存能力,而且维持了遗传物质的稳定性。2、在诱导细胞重编程产生IPS的过程中,基因组DNA会因剧烈的修饰和空间结构变化产生损伤。我们发现△...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：212 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 研究背景和基础理论依据
1.1 p53家族
1.2 p53异构体
1.3 DNA损伤与修复信号通路
1.4 p53家族与IPS
1.5 p53家族与ROS调控
1.6 分子伴侣介导自噬（CMA）
1.7 斑马鱼模式生物简介
2 研究材料与方法总述
2.1 人类细胞系实验体系及相关实验操作
2.1.1 实验用细胞系的常规培养
2.1.2 细胞转染
2.2 人类干细胞实验体系、IPS及相关实验操作
2.2.1 实验用干细胞的正常培养
2.2.2 慢病毒的准备
2.2.3 细胞重编程
2.3 斑马鱼体系及相关实验操作
2.3.1 实验用斑马鱼的品系及饲养
2.3.2 斑马鱼受精卵的获取
2.3.3 受精卵显微注射
2.4 小鼠体系及相关实验操作
2.4.1 实验小鼠品系及饲养
2.4.2 肿瘤移植
2.4.3 动物实验中遵循的伦理规范
2.5 分子克隆及相关实验方法
2.5.1 DNA片段及相关操作
2.5.2 感受态细胞及相关操作
2.6 DNA相关实验总述
2.6.1 基因组总DNA的提取
2.6.2 PI染色测定细胞周期及凋亡
2.6.3 Annexin V/7-AAD双荧光染色检测细胞凋亡与坏死
2.6.4 Tune1方法检测斑马鱼细胞凋亡
2.6.5 Comet试验检测DNA损伤
2.7 RNA相关实验总述
2.7.1 RNA的提取
2.7.2 逆转录及qPCR
2.7.3 半定量PCR
2.7.4 体外转录mRNA
2.7.5 Northern-blot
2.8 蛋白相关实验总述
2.8.1 蛋白的提取
2.8.2 Western-blot
2.8.3 蛋白质降解检测
2.8.4 免疫荧光
2.8.5 蛋白免疫共沉淀
2.8.6 染色质免疫共沉淀（ChIP）
2.8.7 凝胶阻滞实验（EMSA）
2.9 细胞相关实验总述
2.9.1 流式细胞分析（FACS）
2.9.2 细胞集落生成实验（CCA）
2.9.3 细胞活性测定（MTT）
2.9.4 细胞衰老检测
2.9.5 活性氧检测（ROS assay）
2.9.6 GFP-LC3聚集实验（GFP-LC3 aggregation）
2.10 实验中所用试剂总述
2.10.1 常规试剂配方列表
2.10.2 实验中所用抗体列表
2.10.3 实验中所用Morpholino、siRNA列表
2.10.4 实验中所用qPCR引物列表
2.10.5 实验中所用探针合成用引物列表
2.10.6 实验中所用克隆用引物列表
3 可视化DNA双链断裂修复检测系统
3.1 HR、SSA、NHEJ质粒的构建
3.2 基于qPCR方法的定量检测HR、SSA、NHEJ强度系统的构建与检验
3.3 利用可视化检测系统检测斑马鱼中DNA双链断裂修复的强度
3.4 可视化DNA双链断裂修复检测系统的应用
4 △133p53促进DNA双链断裂修复
4.1 γ射线辐射能诱导△113p53/△133p53大量表达
4.2 在斑马鱼中△113p53能促进DNA双链断裂修复,降低DNA损伤积累
4.3 在人类细胞系中△133p53能促进DNA双链断裂修复,降低DNA损伤积累
4.4 △113p53在DNA双链损伤严重时保护斑马鱼,抑制衰老和死亡
4.5 △133p53在DNA双链损伤严重时保护人类细胞,抑制衰老和死亡
4.6 △113p53/△133p53促进DNA双链断裂修复关键基因的表达
4.7 △113p53/△133p53直接调控DNA双链断裂修复途径关键基因的转录
4.8 在DNA双链断裂下p53信号途径调控细胞命运模型
4.9 结果讨论
5 △133p53提高IPSC诱导效率并维持基因组稳定性
5.1 在细胞重编程过程中△133p53能被诱导产生
5.2 △133p53能大幅提高IPS重编程效率
5.3 △133p53在重编程过程中拮抗p53促进产生的细胞凋亡
5.4 △133p53在重编程过程中促进细胞DNA双链断裂修复
5.5 △133p53在重编程过程中保护基因组稳定性
5.6 细胞重编程后产生IPSC的鉴定
5.7 在细胞重编程时△133p53的功能模型
5.8 结果讨论
6 △133p53提高机体在低剂量氧化环境中的适应性
6.1 △133p53在低剂量氧化环境中被诱导表达
6.2 △133p53优化细胞对低剂量氧化环境的适应性
6.3 △113p53优化斑马鱼对低剂量氧化环境的适应性
6.4 △133p53降低细胞内ROS水平
6.5 △133p53通过调节抗ROS基因的表达从而降低细胞内ROS水平
6.6 △133p53直接参与抗ROS基因的转录调控
6.7 机体应对长期低剂量氧化环境的可能的策略模型
6.8 结果讨论
7 在高温下p53抑制过度的CMA保护细胞免于死亡
M214K突变品系比野生型斑马鱼对于40℃相对高温更敏感"> 7.1 p53M214K突变品系比野生型斑马鱼对于40℃相对高温更敏感
7.2 p53缺陷细胞系比p53正常细胞系对于40℃相对高温更敏感
7.3 p53缺陷细胞系比p53正常细胞系对于40℃相对高温更敏感不是由细胞凋亡、坏死和大自噬导致
7.4 p53缺陷细胞系比p53正常细胞系对于40℃相对高温更敏感是由CMA导致
7.5 p53通过p53-HSF1-HSC70信号通路抑制CMA,从而在40℃相对高温下保护人类细胞免于死亡
7.6 p53通过p53-HSF1-HSC70信号通路抑制CMA,从而在40℃相对高温下保护斑马鱼免于死亡
7.7 p53在转录水平调控HSF1表达
7.8 p53在转录水平调控HSF1表达的分子机制
7.9 p53缺陷移植瘤细胞对40℃相对高温处理较p53正常细胞敏感
7.10 结果讨论
8 研究总结
8.1 结论与意义
8.2 课题展望
参考文献
作者简介
致谢
本文编号：2967322
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：212 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 研究背景和基础理论依据
1.1 p53家族
1.2 p53异构体
1.3 DNA损伤与修复信号通路
1.4 p53家族与IPS
1.5 p53家族与ROS调控
1.6 分子伴侣介导自噬（CMA）
1.7 斑马鱼模式生物简介
2 研究材料与方法总述
2.1 人类细胞系实验体系及相关实验操作
2.1.1 实验用细胞系的常规培养
2.1.2 细胞转染
2.2 人类干细胞实验体系、IPS及相关实验操作
2.2.1 实验用干细胞的正常培养
2.2.2 慢病毒的准备
2.2.3 细胞重编程
2.3 斑马鱼体系及相关实验操作
2.3.1 实验用斑马鱼的品系及饲养
2.3.2 斑马鱼受精卵的获取
2.3.3 受精卵显微注射
2.4 小鼠体系及相关实验操作
2.4.1 实验小鼠品系及饲养
2.4.2 肿瘤移植
2.4.3 动物实验中遵循的伦理规范
2.5 分子克隆及相关实验方法
2.5.1 DNA片段及相关操作
2.5.2 感受态细胞及相关操作
2.6 DNA相关实验总述
2.6.1 基因组总DNA的提取
2.6.2 PI染色测定细胞周期及凋亡
2.6.3 Annexin V/7-AAD双荧光染色检测细胞凋亡与坏死
2.6.4 Tune1方法检测斑马鱼细胞凋亡
2.6.5 Comet试验检测DNA损伤
2.7 RNA相关实验总述
2.7.1 RNA的提取
2.7.2 逆转录及qPCR
2.7.3 半定量PCR
2.7.4 体外转录mRNA
2.7.5 Northern-blot
2.8 蛋白相关实验总述
2.8.1 蛋白的提取
2.8.2 Western-blot
2.8.3 蛋白质降解检测
2.8.4 免疫荧光
2.8.5 蛋白免疫共沉淀
2.8.6 染色质免疫共沉淀（ChIP）
2.8.7 凝胶阻滞实验（EMSA）
2.9 细胞相关实验总述
2.9.1 流式细胞分析（FACS）
2.9.2 细胞集落生成实验（CCA）
2.9.3 细胞活性测定（MTT）
2.9.4 细胞衰老检测
2.9.5 活性氧检测（ROS assay）
2.9.6 GFP-LC3聚集实验（GFP-LC3 aggregation）
2.10 实验中所用试剂总述
2.10.1 常规试剂配方列表
2.10.2 实验中所用抗体列表
2.10.3 实验中所用Morpholino、siRNA列表
2.10.4 实验中所用qPCR引物列表
2.10.5 实验中所用探针合成用引物列表
2.10.6 实验中所用克隆用引物列表
3 可视化DNA双链断裂修复检测系统
3.1 HR、SSA、NHEJ质粒的构建
3.2 基于qPCR方法的定量检测HR、SSA、NHEJ强度系统的构建与检验
3.3 利用可视化检测系统检测斑马鱼中DNA双链断裂修复的强度
3.4 可视化DNA双链断裂修复检测系统的应用
4 △133p53促进DNA双链断裂修复
4.1 γ射线辐射能诱导△113p53/△133p53大量表达
4.2 在斑马鱼中△113p53能促进DNA双链断裂修复,降低DNA损伤积累
4.3 在人类细胞系中△133p53能促进DNA双链断裂修复,降低DNA损伤积累
4.4 △113p53在DNA双链损伤严重时保护斑马鱼,抑制衰老和死亡
4.5 △133p53在DNA双链损伤严重时保护人类细胞,抑制衰老和死亡
4.6 △113p53/△133p53促进DNA双链断裂修复关键基因的表达
4.7 △113p53/△133p53直接调控DNA双链断裂修复途径关键基因的转录
4.8 在DNA双链断裂下p53信号途径调控细胞命运模型
4.9 结果讨论
5 △133p53提高IPSC诱导效率并维持基因组稳定性
5.1 在细胞重编程过程中△133p53能被诱导产生
5.2 △133p53能大幅提高IPS重编程效率
5.3 △133p53在重编程过程中拮抗p53促进产生的细胞凋亡
5.4 △133p53在重编程过程中促进细胞DNA双链断裂修复
5.5 △133p53在重编程过程中保护基因组稳定性
5.6 细胞重编程后产生IPSC的鉴定
5.7 在细胞重编程时△133p53的功能模型
5.8 结果讨论
6 △133p53提高机体在低剂量氧化环境中的适应性
6.1 △133p53在低剂量氧化环境中被诱导表达
6.2 △133p53优化细胞对低剂量氧化环境的适应性
6.3 △113p53优化斑马鱼对低剂量氧化环境的适应性
6.4 △133p53降低细胞内ROS水平
6.5 △133p53通过调节抗ROS基因的表达从而降低细胞内ROS水平
6.6 △133p53直接参与抗ROS基因的转录调控
6.7 机体应对长期低剂量氧化环境的可能的策略模型
6.8 结果讨论
7 在高温下p53抑制过度的CMA保护细胞免于死亡
M214K突变品系比野生型斑马鱼对于40℃相对高温更敏感"> 7.1 p53M214K突变品系比野生型斑马鱼对于40℃相对高温更敏感
7.2 p53缺陷细胞系比p53正常细胞系对于40℃相对高温更敏感
7.3 p53缺陷细胞系比p53正常细胞系对于40℃相对高温更敏感不是由细胞凋亡、坏死和大自噬导致
7.4 p53缺陷细胞系比p53正常细胞系对于40℃相对高温更敏感是由CMA导致
7.5 p53通过p53-HSF1-HSC70信号通路抑制CMA,从而在40℃相对高温下保护人类细胞免于死亡
7.6 p53通过p53-HSF1-HSC70信号通路抑制CMA,从而在40℃相对高温下保护斑马鱼免于死亡
7.7 p53在转录水平调控HSF1表达
7.8 p53在转录水平调控HSF1表达的分子机制
7.9 p53缺陷移植瘤细胞对40℃相对高温处理较p53正常细胞敏感
7.10 结果讨论
8 研究总结
8.1 结论与意义
8.2 课题展望
参考文献
作者简介
致谢
本文编号：2967322
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/jckxbs/2967322.html
