迭代酮还原酶SiaM三维结构和酶学性质的研究

发布时间：2017-04-14 17:12

  本文关键词：迭代酮还原酶SiaM三维结构和酶学性质的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：聚酮类化合物是一类具有结构及生物活性多样性的重要天然产物。此类化合物拥有巨大的医用价值,是一类抗细菌、抗真菌以及抗寄生虫的高效抗生素,而且还是非常有潜力的抗癌药物候选分子。聚酮化合物由巨大的、模块化的聚酮合酶(PKSs)合成。PKSs中的每一个模块负责链的延伸和链的修饰。加工好的聚酮化合物则被运输到下一个模块进行链的延伸。PKSs一般参与聚酮化合物的碳骨架的合成,一般具有三个结构域：酮合成酶结构域(KS),乙酰基转移酶结构域(AT)和乙酰转运蛋白结构域(ACP)。除此外,许多PKS模块还具有参与p碳上酮基修饰的酶,即酮还原酶(KRs)。酮还原酶可以将p-酮基还原成p-羟基。在聚酮化合物的生物合成中,酮还原酶(KRs)催化的还原反应决定了p碳的手性特征。目前,几个代表性的聚酮还原酶结构已经被解析出来。其结构中的Rossmann折叠负责结合NADPH辅因子,而催化三联体色氨酸、丝氨酸和赖氨酸则位于NADPH结合位点附近。KRs底物位于烟碱环附近,这使得质子可以进攻β羰基。比对A类型和B类型的KR结构域发现,LDD残基和保守的色氨酸位于活性位点不同的一侧。前期研究显示,LDD残基可以引导底物进入酶活位点。 大部分KRs催化固定长度的底物。最新研究发现,在对称二聚聚酮化合物SIA7248的生物合成中,海洋链霉菌Streptomyces sp. A7248迭代酮还原酶SiaM能够还原不同长度的p酮酯酰底物。为了阐明SiaM的催化机理和底物结合方式,我们解析了其晶体结构。结构分析表明,SiaM的结构与已经报道的其它类型KRs类似,但其保守序列LDD被IRD取代。PISA分析及小角散射实验显示,SiaM在溶液中以四聚体形式存在,其四聚体界面上的芳香族氨基酸残基可以与邻近单体的芳香族残基同时形成平行型和T型芳香堆积作用,这在聚酮合酶中是鲜有报道的。针对这些芳香族氨基酸的突变实验显示,它们在维持SiaM结构稳定与催化功能中起着重要的作用。 将SiaM与NADPH以及与C4-SNAC底物分子进行分子对接,并通过分子动力学模拟表明SiaM_NADPH和SiaM_NADPH_C4-SNAC是稳定的构象。以SiaM_NADPH和SiaM_NADPH_C4-SNAC对接结构模型为基础,针对SiaM与NADPH和C4-SNAC的结合位点设计了一系列突变体。突变体酶活和酶学动力学实验结果显示,Y159、K163、D67和N94氨基酸残基的侧链与NADPH形成氢键作用,对SiaM酶功能起着重要作用。而S146在催化过程中起着电子传递的作用,对酶功能的维持起着关键性的作用。两个疏水氨基酸残基M196和198通过疏水作用与NADPH结合,对稳定酶活性构象起着重要作用。同时,M196和198也通过疏水作用与SiaM底物C4-SNAC结合。并且,F151和M247也通过疏水作用对底物起着固定作用。因此,M196和198很有可能与其它疏水氨基酸残基M247、V147、L191以及F151形成疏水口袋,通过疏水作用与底物结合。同时,Q156、Q198和R206的侧链与C4-SNAC形成氢键作用,对底物起着固定作用。 另外,SiaM_NADPH与不同长度底物(C6-SNAC, C8-SNAC, C10-SNAC)的分子对接和分子动力学模拟结果显示,SiaM的loop区(191-200氨基酸基序)具有较大的摆动性,因此,SiaM可以通过对M196、I98、V147、L191以及M247等形成的疏水口袋大小的调节,以此结合和催化不同长度的底物。 本研究初步阐明了SiaM与不同底物的结合方式,为SiaM的酶工程改造提供了结构基础。
【关键词】：聚酮化合物 酮还原酶 X射线晶体学 小角散射 分子对接 分子动力学模拟 芳香堆积作用
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q55
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 绪论10-57
• 1.1 聚酮化合物的特征及功能10-11
• 1.2 聚酮化合物的生物合成11-15
• 1.3 聚酮合酶遗传学研究进展15-16
• 1.4 聚酮合酶以及ACP的结构研究进展16-20
• 1.5 酮还原酶研究进展20-21
• 1.6 芳香堆积研究进展21-28
• 1.7 圆二色谱研究进展28-31
• 1.8 荧光光谱研究进展31-32
• 1.9 小角散射研究进展32-37
• 1.10 分子对接研究进展37-43
• 1.11 分子动力学模拟研究进展43-45
• 1.12 蛋白质结构研究进展45-53
• 1.13 研究背景及意义53-55
• 1.14 技术路线55-57
• 第二章 SiaM晶体结构的研究57-84
• 2.1 SiaM的蛋白表达、纯化及结晶57-71
• 2.2 SiaM晶体衍射数据的收集及结构解析71-76
• 2.3 SiaM蛋白晶体结构的分析76-83
• 2.4 本章小结83-84
• 第三章 SiaM界面芳香堆积作用的研究84-96
• 3.1 小角散射对溶液中SiaM四聚体的研究84-86
• 3.2 SiaM及其突变体的酶活测定86-91
• 3.3 SiaM及其突变体的荧光光谱分析91-93
• 3.4 SiaM及其突变体的圆二色谱分析93-95
• 3.5 本章小结95-96
• 第四章 SiaM与不同长度底物结合方式的研究96-153
• 4.1 SiaM底物β-keto-butanoyl-SNAC的合成与表征96-102
• 4.2 SiaM同源建模102-105
• 4.3 SiaM与配体分子对接105-119
• 4.4 SiaM和SiaM-配体复合物的分子动力学模拟119-139
• 4.5 SiaM与不同长度底物结合方式的研究139-152
• 4.6 本章小结152-153
• 第五章 总结与展望153-157
• 5.1 全文总结153-155
• 5.2 展望155-157
• 致谢157-159
• 参考文献159-183
• 附录1 博士研究生期间发表的学术论文183-184
• 附录2 基因序列184-185
• 附录3 实验室常用设备185-186

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