犬Ⅲ型干扰素的功能特点及B型流感病毒NEP蛋白出核功能研究

发布时间：2017-04-16 08:03

  本文关键词：犬Ⅲ型干扰素的功能特点及B型流感病毒NEP蛋白出核功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在本研究中,首次对犬Ⅲ型干扰素的功能进行了详细的研究。基于核酸序列的系统进化分析表明,该犬Ⅲ型干扰素与猪IFN-λ1,蝙蝠IFN-λ1和人IFN-λ1自然的聚为一支,表明该犬Ⅲ型干扰素为IFN-λ1。将该IFN-λ1于大肠杆菌中进行了表达,纯化,并对纯化后的蛋白进行了功能研究。结果表明,该IFN-λ1在同种和异种细胞上均具有一定的抗病毒活性,包括VSV病毒、犬细小病毒和H1N1流感病毒等。研究还发现犬IFN-λ1在CMT肿瘤细胞和MDCK细胞上均具有抗增殖活性,且在CMT肿瘤细胞上的抗增殖活性更强。此外,犬IFN-λ1可以激活JAK-STAT信号传导系统。为了验证该犬IFN-λ1是否能诱导干扰素诱导基因的表达,我们还用实时荧光定量PCR的方法检测了犬IFN-λ1刺激MDCK细胞后的ISG15,Mx1和2'5'-OAS表达水平,结果表明,该三种干扰素诱导基因均被显著上调。我们还用同样的方法检测了VSV和流感病毒感染后的MDCK细胞中的IFN-λ1的mRNA水平,结果显示,与对照相比,IFN-λ1的mRNA水平也明显被上调。最后,本研究还通过ELISA的方法进行了犬IFN-λ1与其受体胞外域(IFNλR1-EC)的结合检测,结果显示,犬IFN-λ1能很好的与IFNλR1-EC进行结合。流感病毒的核输出蛋白(NEP蛋白)是病毒粒子中的结构蛋白,由病毒的第八个基因片段编码产生,在病毒的基因组复制与转录,病毒vRNP复合物的细胞核输出过程、病毒粒子的组装、出芽等多个环节发挥着重要作用。目前对B型流感病毒NEP蛋白核穿梭机制的研究还存在很多尚未解决的问题。本研究以BNEP为研究对象,发现了B型流感病毒NEP蛋白上存在三个NES,且都是CRM1依赖的。这三个NES在体内可与CRMl直接结合。这三个NES上的疏水性氨基酸对其功能的发挥都是至关重要的,三个NES共同介导了蛋白的出核。
【关键词】：犬 干扰素λ 干扰素α 抗病毒活性 抗增殖活性 干扰素诱导基因 B型流感病毒 NEP蛋白 NES出核信号 CRM1蛋白
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 文献综述10-48
• 1.1 干扰素的发现及命名10
• 1.2 干扰素的分类10-13
• 1.2.1 Ⅰ型干扰素10-12
• 1.2.2 Ⅱ型干扰素12-13
• 1.2.3 Ⅲ型干扰素13
• 1.3 干扰素的空间结构13-16
• 1.4 干扰素的受体16-18
• 1.5 干扰素的产生途径18-24
• 1.5.1 TLR受体介导的干扰素产生途径19-22
• 1.5.2 RLR介导的干扰素产生途径22-24
• 1.6 干扰素的下游信号通路24-26
• 1.7 干扰素诱导基因26-31
• 1.7.1 ISG1526-28
• 1.7.2 蛋白激酶PKR28-29
• 1.7.3 寡腺苷酸合成酶OAS29-30
• 1.7.4 Mx GTPase30-31
• 1.8 干扰素的表达调控31-32
• 1.9 犬干扰素研究进展32-33
• 1.10 流感病毒的研究进展33-38
• 1.10.1 流感病毒的结构组成34-35
• 1.10.2 流感病毒的复制周期35-36
• 1.10.3 流感病毒的入侵36
• 1.10.4 vRNP的入核36
• 1.10.5 病毒基因组的转录和复制36-37
• 1.10.6 病毒vRNP的出核37
• 1.10.7 流感病毒的包装和出芽37-38
• 1.11 蛋白质的核质转运38-42
• 1.11.1 Ran依赖性的蛋白质核质转运38-41
• 1.11.2 CRM1依赖性的蛋白出核41-42
• 1.12 流感病毒蛋白的核质运输42-43
• 1.12.1 流感病毒vRNP及新合成的蛋白的入核42-43
• 1.12.2 新组装的vRNP的出核43
• 1.13 流感病毒NEP蛋白的研究进展43-48
• 1.13.1 NEP蛋白的结构组成44-45
• 1.13.2 NEP蛋白在流感病毒vRNP出核过程中的作用45-46
• 1.13.3 NEP蛋白在流感病毒转录及复制过程中的作用46-48
• 第二章 犬Ⅲ型干扰素的分子特征及功能研究48-76
• 2.1 引言48
• 2.2 材料与方法48-51
• 2.2.1 主要化学试剂及实验材料48-49
• 2.2.2 工具酶和试剂盒49
• 2.2.3 主要仪器49-50
• 2.2.4 菌株50
• 2.2.5 质粒50
• 2.2.6 毒株和细胞50
• 2.2.7 引物序列50-51
• 2.3 实验方法51-61
• 2.3.1 质粒的构建51-53
• 2.3.2 蛋白质的表达与纯化53-54
• 2.3.3 测定蛋白质浓度54-55
• 2.3.4 western blot免疫印迹分析55
• 2.3.5 干扰素活性测定55-57
• 2.3.6 病毒感染实验57
• 2.3.7 RNA的提取57-58
• 2.3.8 mRNA的反转录58
• 2.3.9 Real-time PCR58-59
• 2.3.10 ELISA59
• 2.3.11 Luciferase实验59-60
• 2.3.12 噬班实验60
• 2.3.13 抗增殖实验60-61
• 2.4 实验结果61-73
• 2.4.1 系统进化分析揭示本研究中发现的犬IFN-λ为IFN-λ161-64
• 2.4.2 犬的IFN-λ、IFN-α7和IFN-λR1-EC的表达及纯化64-65
• 2.4.3 犬IFN-λ,与犬IFN-α7的抗病毒活性比较65-66
• 2.4.4 犬IFN-λ激活JAK-STAT信号通路66-67
• 2.4.5 犬IFN-λ具有抗犬肿瘤细胞A72和MDCK细胞增殖的作用67-68
• 2.4.6 不同病毒感染MDCK细胞后引起的干扰素的mRNA的变化68-70
• 2.4.7 犬IFN-λ和IFN-α7刺激MDCK细胞对干扰素诱导基因的影响70-72
• 2.4.8 干扰素诱导基因表达对犬IFN-λ和IFN-α7具有剂量依赖性72
• 2.4.9 犬IFN-λ与其IFN-λR1受体胞外部分(IFN-λR1-EC)的结合能力测定72-73
• 2.5 讨论73-76
• 第三章 流感病毒感染及CypA对Ⅰ型和Ⅲ型干扰素的转录水平影响的研究76-87
• 3.1 引言76-77
• 3.2 材料与方法77-80
• 3.2.1 细胞77
• 3.2.2 病毒77
• 3.2.3 病毒感染实验77-78
• 3.2.4 RNA的提取78
• 3.2.5 反转录78
• 3.2.6 Real-time PCR78-79
• 3.2.7 Western blot免疫印迹分析79-80
• 3.3 实验结果80-86
• 3.3.1 敲低CypA基因细胞系的验证80-81
• 3.3.2 H1N1-WSN感染不同细胞系对干扰素的影响81-82
• 3.3.3 H1N1-PR8感染不同细胞系的干扰素变化情况82-83
• 3.3.4 H1N1-CA04感染不同细胞系的干扰素变化情况83-85
• 3.3.5 3株流感病毒感染不同细胞系后单一种类干扰素表达的比较85-86
• 3.4 讨论86-87
• 第四章 B型流感病毒NEP蛋白上NES的研究87-99
• 4.1 引言87
• 4.2 材料与方法87-90
• 4.2.1 实验材料87-88
• 4.2.2 实验方法88-90
• 4.3 实验结果90-97
• 4.3.1 对BNEP上NES的序列分析90-91
• 4.3.2 对BNEP上可能的NES的功能鉴定91-92
• 4.3.3 LMB抑制出核实验鉴定BNEP上三个NES的CRM1依赖性92-93
• 4.3.4 BNEP上三个NES与CRM1的体内结合研究93-94
• 4.3.5 NES中疏水性氨基酸对NES出核功能的影响94-96
• 4.3.6 BNEP蛋白的3个NES对定位的影响96-97
• 4.3.7 BNEP蛋白上的3个NES对B型流感病毒复制的影响97
• 4.4 讨论97-99
• 第五章 结论与创新点99-100
• 参考文献100-112
• 博士期间发表文章及专利112-113
• 致谢113

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