Shewanella oneidensis MR-1胞外电子传递网络的遗传学重构

发布时间：2021-05-18 10:05

　　异化金属还原菌（Dissimilatory Metal Reducing Bacteria,DMRB）是一类能利用胞外金属氧化物进行呼吸并储存能量用于生长、代谢的微生物,其底物代谢产生的电子通常需要经过复杂的电子传递网络才能传递给胞外电子受体。除金属氧化物外,DMRB还可以将电子传递给金属离子、电极以及多种污染物。因此,它们在重金属（包括放射性核素）去除、生态修复和能源回收中具有巨大的应用价值。但是,较低的胞外电子传递（Extracellular Electron Transfer,EET）效率是目前制约DMRB在生态修复和能源生产等领域应用的主要瓶颈之一。本论文以Shewanella oneidensis MR-1为底盘微生物,以强化其胞外电子传递能力为目标,研发了一体化CRISPR平台、基因网络集成策略、新型基因组编辑工具、无抗生素基因载体等多种基因工程技术。基于这些技术,继而探究了基因组EET途径的重构和优化对污染物生物降解的强化作用,以及复杂EET基因网络对电子传递的提升作用,并为S.oneidensis进行生态修复提供了科学依据。本文的研究内容和主要结果如下:1.S.onei... 

【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：160 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 引言
    1.2 异化金属还原模式菌-DMRB
        1.2.1 Shewanella属
        1.2.2 Shewanella oneidensis MR-1
    1.3 DMRB的生物学研究
        1.3.1 DMRB的环境分布和功能
        1.3.2 DMRB的分子生物学研究
    1.4 DMRB的胞外电子传递
        1.4.1 NADH池和甲基萘醌类池
        1.4.2 依赖于细胞色素c的直接电子传递
        1.4.3 依赖于纳米导线的电子传递
        1.4.4 依赖于电子穿梭体的间接电子传递
    1.5 基因编辑技术
        1.5.1 基因编辑技术的发展
        1.5.2 基因编辑技术的类型
        1.5.3 基因编辑技术在环境功能微生物中的应用
    1.6 本文研究的主要内容,目的和意义
        1.6.1 研究内容
        1.6.2 研究目的和意义
    参考文献
第二章 S.oneidensis MR-1胞外电子传递链的CRISPR-Cas9基因编辑
    2.1 概述
    2.2 材料和方法
        2.2.1 巢湖底泥基因丰度和群落结构测定
        2.2.2 菌株、质粒及培养条件
        2.2.3 E.coli电转感受态的制备
        2.2.4 基因操作、质粒构建和转移
        2.2.5 GFP-lacZ报告菌株的构建
        2.2.6 “易编辑型”CRISPR-Cas9系统的构建和基因编辑操作流程
        2.2.7 细胞色素c、黄素和NADH的测定方法
        2.2.8 表达基因的定量PCR
        2.2.9 电化学实验方法
        2.2.10 U(Ⅵ)还原实验及产物表征方法
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 功能微生物在巢湖底泥中的分布特征
        2.3.2 借助CRISPR-Cas9开发增强EET能力的CRISPR-GPS
        2.3.3 CRISPR-Cas9系统在S.oneidensis中的效率评估
        2.3.4 基于CRISPR-GPS的胞外电子传递网络的基因编辑
        2.3.5 编辑菌株的生物学特性和电化学特征
        2.3.6 编辑菌株增强U(Ⅵ)还原
    2.4 小结
    参考文献
第三章 S.oneidensis MR-1胞外电子传递基因网络平台的构建和应用
    3.1 概述
    3.2 材料和方法
        3.2.1 菌株、质粒及培养条件
        3.2.2 E.coli电转感受态制备及质粒的构建和转移
        3.2.3 基于Int因子的基因网络平台的构建
        3.2.4 依赖于CRISPR-Cas9_((3.7))系统的基因编辑
        3.2.5 细胞色素c和黄素的测定方法
        3.2.6 表达基因的定量PCR
        3.2.7 电化学实验方法
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 DMRB基因网络平台的构建
        3.3.2 基因网络平台整合-环化效率的评估
        3.3.3 细胞色素c途径的启动子重构和黄素合成途径的快速整合
        3.3.4 工程菌株的生物学特性
        3.3.5 工程菌株的产电能力强化
    3.4 小结
    参考文献
第四章 S.oneidensis MR-1胞外电子传递链I-SceI-RecET的基因编辑
    4.1 概述
    4.2 材料和方法
        4.2.1 菌株、质粒及培养条件
        4.2.2 coli电转感受态制备及质粒的构建和转移
        4.2.3 基因操作及蓝白斑筛选实验
        4.2.4 细胞色素c和吩嗪的测定方法
        4.2.5 异源基因表达的定量PCR
        4.2.6 电化学测试方法
        4.2.7 污染物还原实验
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 iEditing基因编辑工具的设计和构建
        4.3.2 编辑工具在S.oneidensis中的验证
        4.3.3 偶联重组系统提高基因组编辑效率
        4.3.4 在S.oneidensis中重构额外的EET途径
        4.3.5 编辑菌株的生物学和电化学特性
        4.3.6 编辑菌株强化污染物还原
        4.3.7 编辑工具在其他革兰氏阴性菌中的应用
    4.4 小结
    参考文献
第五章 S.oneidensis MR-1中不依赖于抗生素遗传操作平台的设计和建立
    5.1 概述
    5.2 材料和方法
        5.2.1 菌株、质粒及培养条件
        5.2.2 E.coli电转感受态制备及质粒构建和转移
        5.2.3 基因操作及质粒稳定性的测定
        5.2.4 细胞色素c和甲基萘醌的测定
        5.2.5 基因表达的定量PCR
        5.2.6 电化学测试方法
        5.2.7 污染物的还原实验
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 基于I-SceI的S.oneidensis MR-1大质粒消除
        5.3.2 基于内源质粒复制起始因子的质粒平台构建
        5.3.3 不依赖于抗生素工程菌株的构建
        5.3.4 细胞色素c和甲基萘醌过表达菌株的构建与表征
        5.3.5 强化染料和重金属还原
    5.4 小结
    参考文献
结论
致谢
在读期间发表的学术论文



本文编号：3193601