塞内卡病毒qPCR、ddPCR方法的建立及标准物质的制备研究
发布时间：2021-06-16 06:30
塞内卡病毒（Seneca Valley virus,SVV）,在遗传上与小RNA病毒科、心病毒属病毒关系相近,临床上能引起猪的鼻吻、蹄冠状带部位出现水疱样病变,偶见腹泻症状,病情急促,新生仔猪病死率高,我国现已出现多省份猪场感染SVV的病例,猪群感染SVV后表现的临床症状与口蹄疫、猪水疱病、水泡性口炎、猪水泡疹等病毒感染后症状非常相似,在临床症状上常常引起混淆。如果未能对以上几种疫病及时作出准确的鉴别诊断,将导致防控措施采取不当,养殖成本大大提高。在我国,2016年首次分离到了SVV。国内外对SVV感染的实验室检测已经开发了电子显微镜、免疫组化、RT-PCR等检测方法。数字PCR（dPCR）技术作为建立在qPCR检测方法的基础上的核酸绝对定量的新技术,与此前发展起来的qPCR核酸相对定量方法比较,其定量方法更加灵敏和准确度更高,而且不需要建立标准曲线可直接判断结果。核酸标准物质是验证SVV检测方法、检测试剂是否科学、可靠的关键,也是实验室质量控制的重要手段,因此核酸标准物质的研制可为精准化疫病防控提供技术保障。国内针对塞内卡病毒检测方法的标准物质十分匮乏,各级检测机构缺少核酸标准物质。...
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：102 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
FMDVRT-PCR扩增Fig.2-1RT-PCRamplificationofFMDV
塞内卡病毒qPCR、ddPCR方法的建立及标准物质的制备研究13图2-1FMDVRT-PCR扩增Fig.2-1RT-PCRamplificationofFMDV注：M．蛋白质相对分子质量标准；１.FMDV扩增条带Note:M.proteinrelativemolecularmassstandard;1.FMDVamplificationband图2-2SVVRT-PCR扩增Fig.2-2RT-PCRamplificationofSVV注：M．蛋白质相对分子质量标准；１.SVV扩增条带Note:M.proteinrelativemolecularmassstandard;1.SVVamplificationband2.2FMDV/SVV二重qPCR反应条件的优化优化的25μLPCR反应体系中，FMDV/SVVP1/P2、P3/P4终浓度各0.4μmol/L，Probe-P5终浓度为0.6μmol/L，Probe-P6终浓度为0.7μmol/L，2.5mmol/LdNTPs2μL，10×ExTaq酶缓冲液2.5μL，5U/μLExTaqDNA酶0.25μL，1.0×105拷贝/μL的cDNA模板各2μL，补足去离子水至终体积25μL。优化的PCR反应程序为：94℃，5min；94℃15s，60℃30s，40个循环。结果判定：阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值＞33.0或无，阳性对照的Ct值应≤30.0，且出现特定的扩增曲线，判定检测结果成立。在检测结果成立的前提下，若样品检测结果Ct值≤30.0，而且出现特定的扩增曲线，判定为阳性；Ct值＞33.0或无，并且无特定的扩增曲线，则判定为阴性；30.0＜Ct值≤33.0且有特定扩增曲线的样品判定为可疑，扩增曲线如图所示。
甘肃农业大学2015届兽医博士学位论文14图2-3FMDV/SVV二重qPCR的扩增曲线Fig.2-3ThekineticcurvefordoubleqPCRofFMDV-T/FMDV-A注：1.FMDV阳性对照；2.SVV阳性对照；3，阴性对照Note:1.FMDpositivecontrol；2.FMD/Apositivecontrol；3-4.Negativecontro2.3敏感性试验二重qPCR检测FMDV和SVV最低检出限均为1.0×101拷贝/μL，101～106拷贝/μL模板范围内的扩增曲线有很好的线性关系，如图所示。图2-4FMDV敏感性试验结果Fig.2-4SensitivitytestforFMDVqPCR注：1～7.1.0×106～1.0拷贝/μL的FMDVcDNA；8.阴性对照Note:1～7.ReprecentsFMDVcDNAwas1.0×106-1.0copies/μLrespectively；8.Negativecontrol
【参考文献】：
期刊论文
[1]豫北塞尼卡谷病毒VP1基因的扩增和序列分析[J]. 周玲玲,林正丹,时志琪,马园园,张慢. 今日畜牧兽医. 2019(10)
[2]非洲猪瘟病毒国家标准物质的研制[J]. 原霖,杨林,辛盛鹏,宋晓晖,董浩,刘洋,韩焘,高旭年,李尔华,钟凤然,陈亚娜,王传彬. 中国兽医杂志. 2019(09)
[3]非洲猪瘟病毒微滴数字PCR检测方法的建立[J]. 原霖,董浩,倪建强,刘洋,陈亚娜,杨林,宋晓晖,王传彬. 畜牧与兽医. 2019(07)
[4]高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒国家核酸标准物质的研制[J]. 原霖,李尔华,董浩,陈亚娜,鞠厚斌,张红丽,王林,宋晓晖,杨林,王传彬. 中国兽医学报. 2019(05)
[5]塞内卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 王淑娟,王东方,赵月龙,谢彩华,赵雪丽,马震原,王华俊,杨朋霞,闫若潜. 中国预防兽医学报. 2019(05)
[6]猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株国家核酸标准物质的研制[J]. 原霖,钟凤然,董浩,陈亚娜,孙圣福,柴方红,宋晓晖,翟新验,杨林,王传彬. 中国兽医学报. 2019(04)
[7]健康猪体内塞尼卡病毒的分离和鉴定[J]. 张志,张丽丽,张美晶,刘爽,张峰,董雅琴,张慧,崔进,吴发兴,李晓成. 中国预防兽医学报. 2019(04)
[8]一种塞内卡病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 王秀明,陈君彦,魏学峰,刘国英,关平原,范秀丽,张贵刚,武瑾贤,王艳杰,刘建奇. 畜牧兽医科学(电子版). 2019(04)
[9]猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲经典株国家核酸标准物质的研制[J]. 原霖,高旭年,董浩,陈亚娜,闫若潜,兰德松,宋晓晖,吴佳俊,杨林,王传彬. 畜牧与兽医. 2018(11)
[10]猪圆环病毒1型微滴数字PCR定量检测方法的建立[J]. 原霖,訾占超,亢文华,李晓霞,汪葆玥,王静,韩焘,陈亚娜,倪建强,翟新验. 中国兽医学报. 2017(11)
本文编号：3232562
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：102 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
FMDVRT-PCR扩增Fig.2-1RT-PCRamplificationofFMDV
塞内卡病毒qPCR、ddPCR方法的建立及标准物质的制备研究13图2-1FMDVRT-PCR扩增Fig.2-1RT-PCRamplificationofFMDV注：M．蛋白质相对分子质量标准；１.FMDV扩增条带Note:M.proteinrelativemolecularmassstandard;1.FMDVamplificationband图2-2SVVRT-PCR扩增Fig.2-2RT-PCRamplificationofSVV注：M．蛋白质相对分子质量标准；１.SVV扩增条带Note:M.proteinrelativemolecularmassstandard;1.SVVamplificationband2.2FMDV/SVV二重qPCR反应条件的优化优化的25μLPCR反应体系中，FMDV/SVVP1/P2、P3/P4终浓度各0.4μmol/L，Probe-P5终浓度为0.6μmol/L，Probe-P6终浓度为0.7μmol/L，2.5mmol/LdNTPs2μL，10×ExTaq酶缓冲液2.5μL，5U/μLExTaqDNA酶0.25μL，1.0×105拷贝/μL的cDNA模板各2μL，补足去离子水至终体积25μL。优化的PCR反应程序为：94℃，5min；94℃15s，60℃30s，40个循环。结果判定：阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值＞33.0或无，阳性对照的Ct值应≤30.0，且出现特定的扩增曲线，判定检测结果成立。在检测结果成立的前提下，若样品检测结果Ct值≤30.0，而且出现特定的扩增曲线，判定为阳性；Ct值＞33.0或无，并且无特定的扩增曲线，则判定为阴性；30.0＜Ct值≤33.0且有特定扩增曲线的样品判定为可疑，扩增曲线如图所示。
甘肃农业大学2015届兽医博士学位论文14图2-3FMDV/SVV二重qPCR的扩增曲线Fig.2-3ThekineticcurvefordoubleqPCRofFMDV-T/FMDV-A注：1.FMDV阳性对照；2.SVV阳性对照；3，阴性对照Note:1.FMDpositivecontrol；2.FMD/Apositivecontrol；3-4.Negativecontro2.3敏感性试验二重qPCR检测FMDV和SVV最低检出限均为1.0×101拷贝/μL，101～106拷贝/μL模板范围内的扩增曲线有很好的线性关系，如图所示。图2-4FMDV敏感性试验结果Fig.2-4SensitivitytestforFMDVqPCR注：1～7.1.0×106～1.0拷贝/μL的FMDVcDNA；8.阴性对照Note:1～7.ReprecentsFMDVcDNAwas1.0×106-1.0copies/μLrespectively；8.Negativecontrol
【参考文献】：
期刊论文
[1]豫北塞尼卡谷病毒VP1基因的扩增和序列分析[J]. 周玲玲,林正丹,时志琪,马园园,张慢. 今日畜牧兽医. 2019(10)
[2]非洲猪瘟病毒国家标准物质的研制[J]. 原霖,杨林,辛盛鹏,宋晓晖,董浩,刘洋,韩焘,高旭年,李尔华,钟凤然,陈亚娜,王传彬. 中国兽医杂志. 2019(09)
[3]非洲猪瘟病毒微滴数字PCR检测方法的建立[J]. 原霖,董浩,倪建强,刘洋,陈亚娜,杨林,宋晓晖,王传彬. 畜牧与兽医. 2019(07)
[4]高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒国家核酸标准物质的研制[J]. 原霖,李尔华,董浩,陈亚娜,鞠厚斌,张红丽,王林,宋晓晖,杨林,王传彬. 中国兽医学报. 2019(05)
[5]塞内卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 王淑娟,王东方,赵月龙,谢彩华,赵雪丽,马震原,王华俊,杨朋霞,闫若潜. 中国预防兽医学报. 2019(05)
[6]猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株国家核酸标准物质的研制[J]. 原霖,钟凤然,董浩,陈亚娜,孙圣福,柴方红,宋晓晖,翟新验,杨林,王传彬. 中国兽医学报. 2019(04)
[7]健康猪体内塞尼卡病毒的分离和鉴定[J]. 张志,张丽丽,张美晶,刘爽,张峰,董雅琴,张慧,崔进,吴发兴,李晓成. 中国预防兽医学报. 2019(04)
[8]一种塞内卡病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 王秀明,陈君彦,魏学峰,刘国英,关平原,范秀丽,张贵刚,武瑾贤,王艳杰,刘建奇. 畜牧兽医科学(电子版). 2019(04)
[9]猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲经典株国家核酸标准物质的研制[J]. 原霖,高旭年,董浩,陈亚娜,闫若潜,兰德松,宋晓晖,吴佳俊,杨林,王传彬. 畜牧与兽医. 2018(11)
[10]猪圆环病毒1型微滴数字PCR定量检测方法的建立[J]. 原霖,訾占超,亢文华,李晓霞,汪葆玥,王静,韩焘,陈亚娜,倪建强,翟新验. 中国兽医学报. 2017(11)
本文编号：3232562
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