重组再生蛋白3的表达及抗菌活性的研究

发布时间：2017-04-26 20:16

  本文关键词：重组再生蛋白3的表达及抗菌活性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景： 哺乳动物肠道内生长着大量的细菌，这些细菌和宿主保持着共生关系。同时，，肠道也是病原微生物进入宿主体内的主要通道。要面对如此复杂的微生物环境而不致病，肠道粘膜细胞产生各种内源性抗菌物质，来保持对肠腔内细菌的动态限制，否则如果细菌透过肠粘膜进入血液中就会导致感染和菌血症。 再生蛋白3（regenerating protein3，Reg3）是一组由小肠paneth细胞分泌到肠腔的抗菌蛋白，大小约为16KD，包括小鼠Reg3γ和人Reg3A。我们既往研究发现小鼠肠道内细菌感染或葡聚糖硫酸酯钠(DSS)诱导的小鼠肠炎模型中，小鼠肠粘膜细胞Reg3γmRNA明显上调。炎性肠道病患者肠道粘膜再生蛋白Reg3AmRNA也明显上调。越来越多的研究表明再生蛋白3在调节哺乳动物肠道内细菌和宿主之间的内环境稳定具有重要的意义。 除了抗菌作用外，再生蛋白3还参与多种类型细胞的增殖和分化，并且具有抗凋亡和促有丝分裂等作用，与糖尿病、肿瘤及炎性肠道病等多种疾病相关。目前，对于该类蛋白的表达和调控，抗菌功能功能的具体机制还不清楚。所以利用生物工程技术体外表达重组再生蛋白3对于进一步深入研究其各种功能及作用机制有重要的意义。 研究目的： 1、建立高效的重组小鼠Reg3γ和人Reg3A在大肠杆菌中的表达、纯化方法。 2、对重组蛋白质进行鉴定及分析。 3、对重组蛋白质进行体外抗菌功能的初步测定。 研究方法： 1、根据Reg3(小鼠Reg3γ和人Reg3A)的cDNA序列通过PCR扩增，并插入pET30b (+)质粒。重组质粒转化大肠杆菌DH5α，质粒扩增后提纯鉴定。构建成功的重组质粒转化蛋白质表达大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)-RIL，通过IPTG诱导进行表达。大肠杆菌通过超声破碎，包涵体蛋白质变性溶解后复性、透析，所得重组蛋白通过离子交换层析及分子筛凝胶过滤进行纯化。 2、对重组Reg3蛋白质进行鉴定。通过考马斯亮兰染色和Westernblotting对重组蛋白进行鉴定。重组蛋白行体外胰蛋白酶酶切，酶切产物进行可溶性检测。 3、通过平板菌落计数（CFU）方法对Reg3γ和Reg3A重组蛋白及其酶切蛋白进行体外抗菌功能分析。研究细菌选用革兰氏阳性的粪肠球菌和革兰氏阴性的大肠杆菌。 数据均用SPSS软件分析v20.0（IBM，USA）。组间数据比较使用independent t test, P＜0.05认为有统计学意义。 结果： 1、重组质粒的构建 为了进一步研究再生蛋白3的相关功能，我们通过基因工程技术重组表达了小鼠Reg3γ和人Reg3A蛋白。根据GenBank数据库提供的基因序列设计引物，PCR扩增目的基因，将鼠Reg3γ和人Reg3A基因插入pET-30b(+)质粒成功构建成重组质粒pET-30b(+)-Reg3γ和pET-30b(+)-Reg3A。 2、重组Reg3蛋白质在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定 本研究通过小量制备确定了重组Reg3γ和Reg3A蛋白质在大肠杆菌中表达的最佳诱导条件：IPTG诱导浓度使用0.5mM/L，诱导时间为6小时。小量制备结果显示重组Reg3γ和Reg3A蛋白质在大肠杆菌中表达形式是不溶的包涵体状态，与实验设计相符。为取得有功能的重组蛋白需要进一步行包涵体的溶解复性和纯化。 根据小量制备确定的条件，我们进行了重组Reg3γ和Reg3A蛋白的大量表达。大量表达的重组蛋白在细菌中形成包涵体。使用重悬缓冲液将经过超声碎裂细菌后释放的包涵体溶解，加入到复性液中。复性后的重组蛋白通过双重透析析出小分子杂质，经过滤及离子交换层析初步纯化。重组蛋白经进一步凝胶过滤纯化后，除去重组蛋白中的大分子杂质。 重组Reg3γ和Reg3A蛋白经考马斯亮兰染色和Westernblotting鉴定确认蛋白表达成功。我们还对两种重组蛋白进行胰蛋白酶体外酶切，确认了重组Reg3γ和Reg3A蛋白质和其它再生蛋白家族成员类似可以被胰蛋白酶水解成较小的蛋白质。我们还检测了酶切重组蛋白质的可溶性变化，发现重组Reg3γ和Reg3A蛋白质在酶切后具有有不溶的倾向。 3、重组蛋白体外抗菌活性的研究 通过CFU(colony forming units)检测方法证明了重组Reg3γ和Reg3A蛋白对革兰氏阳性菌（粪肠球菌）有体外抗菌活性。该抗菌活性可在重组蛋白被胰蛋白酶酶切后明显增强。两种重组再生蛋白对革兰氏阴性大肠杆菌无明显体外抗菌活性。 综上，本研究将为进一步研究再生蛋白3的功能及作用机制提供了基础。
【关键词】：再生蛋白 蛋白质 表达 纯化
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q51;Q78
【目录】：

• 前言4-5
• 中文摘要5-9
• Abstract9-14
• 英文缩写词表14-16
• 第1章 绪论16-28
• 1.1 再生蛋白家族各成员的发现和命名16-18
• 1.2 再生蛋白家族的功能和相关疾病18-24
• 1.2.1 再生蛋白家族的抗菌作用18-20
• 1.2.2 再生蛋白家族与糖尿病20-22
• 1.2.3 再生蛋白家族与炎症、创伤反应22-23
• 1.2.4 再生蛋白家族与肿瘤23-24
• 1.3 再生蛋白家族表达调控24-26
• 1.4 课题的研究意义26
• 1.5 技术路线26-28
• 第2章 材料与方法28-52
• 2.1 重组质粒构建28-37
• 2.1.1 材料28-30
• 2.1.2 方法30-37
• 2.2 重组蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化37-46
• 2.2.1 材料37-41
• 2.2.2 方法41-46
• 2.3 重组蛋白的鉴定46-49
• 2.3.1 材料46-47
• 2.3.2 方法47-49
• 2.4 重组蛋白体外抗菌活性研究49-52
• 2.4.1 材料49-50
• 2.4.2 方法50-52
• 第3章 实验结果52-66
• 3.1 重组质粒的构建52-55
• 3.1.1 目的基因的扩增和鉴定52
• 3.1.2 载体构建方式52-53
• 3.1.3 菌液直接 PCR 鉴定53-54
• 3.1.4 重组质粒的双酶切鉴定54-55
• 3.2 重组 Reg3 蛋白质在大肠杆菌中的表达和纯化55-60
• 3.2.1 重组蛋白的小量制备55-57
• 3.2.2 重组蛋白的表达和纯化57-60
• 3.3 重组蛋白的鉴定60-63
• 3.4 重组蛋白体外抗菌活性研究63-66
• 第4章 讨论66-72
• 4.1 重组质粒的构建和表达菌株的选择66-67
• 4.2 重组 Reg3 蛋白质在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定67-69
• 4.3 重组蛋白体外抗菌活性的研究69-72
• 第5章 结论72-74
• 参考文献74-84
• 作者简介84-86
• 攻读博士期间所得的科研成果86-87
• 致谢87

【共引文献】

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本文编号：329158