Ly108-SAP调节T细胞与抗原呈递细胞相互作用的机制

发布时间：2017-04-26 20:19

  本文关键词：Ly108-SAP调节T细胞与抗原呈递细胞相互作用的机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：生发中心是次级淋巴器官中B细胞滤泡区所分化出来的特殊结构,主要由生发中心B细胞和一些特化的基质细胞组成,是B细胞受体(BCR)产生高频突变、同种型转换从而产生高亲和力抗体的区域。生发中心反应需要抗原特异的T细胞与B细胞的合作,在体内主要体现在长时间的T、B细胞相互作用上。淋巴细胞激活信号分子相关蛋白(Signaling Lymphocytic Activation Molecule(SLAM)-Associated Protein,SAP)是由SH2D1A基因编码的一种胞内接头蛋白,它仅由一个SH2结构域和C端二十几个氨基酸组成,在哺乳动物中高度保守,通过结合SLAM家族分子的胞内端进行信号传导,是T、B细胞稳定的相互作用所必须的。而SLAM家族分子是一系列的跨膜受体,在T、B以及树突状细胞上均有表达,主要进行同型相互作用(homotypic interaction),其成员之一Ly108可能负向的调节T、B细胞相互作用。通过细胞共轭结合实验(conjugate assay)活体双光子实时成像技术、结构化照明显微镜技术等实验技术手段,我们的工作表明:除了磷酸化酪氨酸结合位点以外,SAP并不包含其他基序(motif),因此并不能通过招募其他信号分子来介导T、B细胞相互作用;Ly108不仅仅能抑制T、B细胞相互,而且能抑制T细胞与树突状细胞(DC)的相互作用。其机制是Ly108在两个层次上与CD3相互作用,抑制CD3?的磷酸化,从而抑制T细胞与抗原呈递细胞的相互作用。在静息状态的细胞中,尽管TCR并没有被刺激,Ly108也没有被交联,Ly108与CD3复合体会在100-200 nm的分辨率上共定位。由于Ly108与磷酸酶SHP-1持续结合,Ly108与CD3的共定位将降低CD3的磷酸化水平,即使在正常的、表达SAP的T细胞中也是如此。当Ly108由于细胞-细胞相互作用而被交联,Ly108将进一步与CD3?相互作用,导致更为有效的CD3?去磷酸化,并且这一过程是依赖于的跨膜域的。如果将Ly108的跨膜域替换掉,静息状态下持续的Ly108-CD3?共定位及去磷酸化依然存在,但是Ly108交联之后的Ly108-CD3?共定位及去磷酸化会丧失,Ly108将不再能抑制抗原特异的T、B相互作用。这些结果阐明了SAP和Ly108对立的调节TCR近端信号(proximal signaling)从而调控抗原特异的T细胞-抗原呈递细胞相互作用的机制。本课题首次发现Ly108独特的跨膜序列对TCR信号的影响,并且提出了一个全新的SAP蛋白的作用模式。
【关键词】：SAP Ly108 CD3 活体成像 T-B细胞相互作用
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q25
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-10
• 主要符号对照表10-11
• 第1章 引言11-23
• 1.1 X染色体连锁的淋巴细胞增多症11-12
• 1.2 含有SH2结构域的SAP蛋白家族分子12-13
• 1.3 SLAM家族跨膜受体分子13-17
• 1.3.1 概论13
• 1.3.2 SLAM受体基因家族13-16
• 1.3.3 SLAM家族受体分子的同种型16-17
• 1.4 SLAM家族受体分子的信号转导17-19
• 1.5 生发中心反应19-23
• 1.5.1 生发中心的结构和功能19-21
• 1.5.2 生发中心中的T细胞21-23
• 第2章 实验材料与方法23-47
• 2.1 实验材料23-30
• 2.1.1 实验动物23
• 2.1.2 质粒23
• 2.1.3 大肠杆菌培养基23-24
• 2.1.4 动物细胞培养基24
• 2.1.5 试剂购买24-25
• 2.1.6 试剂配置25-27
• 2.1.7 蛋白质电泳相关试剂、缓冲液的配制27-28
• 2.1.8 核酸电泳相关试剂、缓冲液的配制28-29
• 2.1.9 蛋白杂交相关试剂、缓冲液的配制29
• 2.1.10 主要仪器29-30
• 2.2 实验方法30-47
• 2.2.1 分离原代T、B淋巴细胞30-31
• 2.2.2 淋巴细胞cDNA的制备31-33
• 2.2.3 普通载体的构建33-36
• 2.2.4 基因定点突变36-37
• 2.2.5 转染级质粒的提取37
• 2.2.6 逆转录病毒的包装37-38
• 2.2.7 T淋巴细胞的体外活化与培养38
• 2.2.8 逆转录病毒感染T淋巴细胞38-39
• 2.2.9 B淋巴细胞的体外活化与培养39
• 2.2.10 骨髓重建以及树突状细胞的分离39-40
• 2.2.11 体外共轭结合实验（conjugate assay）40
• 2.2.12 SAP蛋白的胞内染色40
• 2.2.13 T细胞表面分子染色及流式分析40-41
• 2.2.14 免疫共沉淀41-42
• 2.2.15 免疫印迹42
• 2.2.16 双光子活体成像42-43
• 2.2.17 结构化照明显微镜样品的制备及拍摄43-44
• 2.2.18 荧光共振能量转移成像44-45
• 2.2.19 数据统计及分析45-47
• 第3章 SAP并非通过招募正向信号分子从而促进T、B细胞抗原特异相互作用47-53
• 3.1 本章引论47
• 3.2 实验结果47-51
• 3.2.1 SAP蛋白的C端尾部氨基酸并不是T、B细胞稳定相互作用所必需的48-49
• 3.2.2 SAP蛋白的同源分子EAT- 2 蛋白的SH2结构域同样可以拯救SAP敲除的T细胞，，促进抗原特异的T、B相互作用49
• 3.2.3 所有SAP突变分子均可以拯救SAP敲除的T细胞，促进抗原特异的T、B相互作用49-50
• 3.2.4 SAP电荷颠倒突变分子S85R-K 89D同样可以可以拯救SAP敲除的T细胞50-51
• 3.3 本章小结与讨论51-53
• 第4章 Ly108跨膜蛋白可以抑制T、B以及T、DC抗原特异的相互作用53-57
• 4.1 本章引论53
• 4.2 实验结果53-56
• 4.2.1 SLAM家族受体分子Ly108能抑制T、B细胞的相互作用53
• 4.2.2 在DC上强迫性过表达Ly108同样能抑制T、DC相互作用53-56
• 4.3 本章小结与讨论56-57
• 第5章 SAP通过替换Ly108胞内端结合的SHP-1 从而促进T、B细胞相互作用57-62
• 5.1 本章引论57
• 5.2 实验结果57-60
• 5.2.1 野生型细胞而非SAP敲除细胞中，结合在Ly108胞内端的SHP-1随着TCR刺激而减少57-58
• 5.2.2 游离的Ly108胞内端可以竞争性的减少结合在Ly108分子上的SHP- 158-59
• 5.2.3 游离的Ly108胞内端可以在体外T、B共轭结合实验中拯救SAP敲除的T细胞59
• 5.2.4 在小鼠体内，细胞膜上的Ly108- SHP- 1 复合体抑制了T、B细胞的抗原特异相互作用59-60
• 5.3 本章小结与讨论60-62
• 第6章 SAP和Ly108通过调节CD3z周围的SHP-1 来调控CD3ζ的磷酸化程度62-67
• 6.1 本章引论62
• 6.2 实验结果62-64
• 6.2.1 SAP蛋白在TCR受体识别抗原后的T、B相互作用早期就是必需的62
• 6.2.2 Ly108- SHP- 1 复合体降低CD3ζ的磷酸化水平62-64
• 6.2.3 Ly108与CD3ζ在细胞膜上持续共定位64
• 6.3 本章小结与讨论64-67
• 第7章 Ly108的胞内端和跨膜域影响Ly108与TCR复合体的共定位67-76
• 7.1 本章引论67
• 7.2 实验结果67-74
• 7.2.1 Ly108的胞内端影响Ly108与TCR复合体的共定位69
• 7.2.2 Ly108被招募到T、B细胞相互作用形成的免疫突触中69
• 7.2.3 Ly108的反式交联不依赖于TCR和SAP69-71
• 7.2.4 Ly108的反式交联导致其进一步与TCR复合体共定位及相互作用，并且该过程依赖于Ly108的跨膜域71-72
• 7.2.5 Ly108的跨膜域是Ly108抑制CD3ζ的磷酸化从而抑制T、B细胞抗原特异相互作用所必需的72-74
• 7.2.6 Ly108的跨膜域中的TISIIS氨基酸是其抑制作用所必须的74
• 7.3 本章小结与讨论74-76
• 第8章 讨论与展望76-81
• 参考文献81-103
• 致谢103-105
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果105

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 ;2012年诺贝尔化学奖研究成果——“G蛋白偶联受体”解开20世纪最难解之谜[J];山东大学学报(理学版);2012年11期

2 胡为民,程惊秋,李胜富,卢晓风,万琳,李幼平;人外周血单个核细胞与猪内皮细胞相互作用表达上调基因的鉴定[J];四川大学学报(医学版);2003年02期

3 张卉U

本文编号：329170