若干酶反应抑制剂的研制及检测新方法的构建

发布时间：2017-04-27 00:09

  本文关键词：若干酶反应抑制剂的研制及检测新方法的构建，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：酶(enzyme)是一种生物催化剂,高效地催化多种生物化学反应,而且,机体新陈代谢所包括的所有化学反应几乎都受酶的催化,只有相应酶存在时,人体内才能进行对应的生命活动。另一方面,有机体的生命活动表现了它内部化学反应历程的有序性,这种有序性是受多方面因素控制的,一旦破坏了这种有序性,就会导致代谢紊乱,产生疾病,甚至死亡。大量的研究表明,人体许多疾病的发生与人体内某些酶的活性高低有关,酶反应的调节能够改善和治疗疾病,而许多活性物质正是通过抑制酶反应来发挥作用。因此,研制新型酶反应抑制剂、构建抑制剂检测的新方法,具有非常重要的意义。基于此,本论文研制了抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶水解反应的活性物质,即淀粉-果胶复合物、淀粉-膳食纤维复合物和木质素,并建立了检测二肽基肽酶IV和醌氧化还原酶抑制剂的电化学检测方法。本论文的主要研究内容如下:1.淀粉-果胶复合物对α-淀粉酶水解反应抑制作用的研究作为糖尿病药物靶点酶,α-淀粉酶水解反应的抑制能够减轻糖尿病症状,促进人体健康。在论文本部分中,我们利用三偏磷酸钠为交联剂,将淀粉与果胶进行交联,研制了一种新型化学修饰的抗性淀粉,即淀粉-果胶复合物,这种复合物能够抵抗α-淀粉酶的催化水解。研究表明,在该复合物中,淀粉部分的晶体类型没有发生变化,但其结晶度增加,此外,复合物的热稳定性以及结构均质性与结晶区的双螺旋序列正相关。因此,在论文此部分,我们不仅研制了一种新型的能够抑制α-淀粉酶水解的淀粉-果胶复合物,而且提出了制备抑制剂复合物的新方法。2.淀粉-可溶性膳食纤维复合物对α-淀粉酶水解反应抑制作用的研究在论文这一部分,我们分别使用传统湿热法(CHMT)和微波湿热法(MHMT)两种处理方法,将淀粉与可溶性膳食纤维(SDF)交联起来,制备得到了抗性淀粉-SDF复合物。研究表明,经CHMT法得到的淀粉-SDF复合物几乎完全抑制了α-淀粉酶的水解,但由MHMT法制得的复合物抑制效果不明显。进一步研究发现,在CHMT中,SDF与位于无定型区葡萄糖分子2、3或6-OH相连接,结合至整个淀粉颗粒的外表层,这种结合使得整个淀粉颗粒难于被酶水解。然而,在MHMT中,SDF与破损了的淀粉颗粒的无定型区结合,使得制备得到的复合物具有较高的均质性,导致了其难于抑制水解酶的水解。因此,在论文此部分,我们不仅成功制备得到了能够几乎完全抑制α-淀粉酶水解的淀粉-SDF复合物,而且初步揭示了α-淀粉酶被抑制的机理。3.木质素对α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究作为治疗糖尿病的靶点酶,α-葡萄糖苷酶的抑制剂发现具有重要的临床意义。我们在论文本部分中的研究发现,木质素是α-葡萄糖苷酶的有效抑制剂,其半数抑制浓度为0.076μM,远低于市售糖尿病药物阿卡波糖的半数抑制浓度(0.66 m M)。进一步研究表明,木质素能够竞争性地抑制α-葡萄糖苷酶活性,Ki值为0.3×10-5 M,同时,木质素能与α-葡萄糖苷酶作用形成1:1的复合物,在293 K时的结合常数为1.39×106 M-1,两者间的主要结合力是疏水作用和氢键,结合距离为3.54 nm。此外,研究发现,木质素-α-葡萄糖苷酶复合物的形成改变了α-葡萄糖苷酶的α-螺旋结构和芳香族氨基酸侧链的构象,增加了蛋白颗粒的体积,木质素与α-葡萄糖苷酶的结合符合一级指数衰减函数。因此,论文此部分工作不仅发现了一种新的抑制剂,而且为开发木质素作为糖尿病治疗的活性物质提供了科学依据。4.二肽基肽酶IV抑制剂电化学检测方法的构建针对当前糖尿病药物治疗的靶点酶即二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制剂筛选方法的缺陷,我们提出了一种该酶活性检测及其抑制剂筛选的电化学方法。在该方法中,我们将酶的底物Fc-多肽连接于金纳米颗粒表面,并利用苯环层和金纳米颗粒对信号进行双重放大,使得DPP-IV的最低检测浓度为39 n U/m L,线性检测范围为0.5μU/m L至2.5 m U/m L。同时,利用这一新方法,我们还评价了抑二肽素A和His-Leu双肽对DPP-IV活性的抑制作用,测定得到二者的半数抑制浓度分别为93.5μM和95.5μM。此外,该方法快速、准确、选择性好,可用于其他多肽酶以及蛋白酶的活性检测与抑制剂筛选。5.醌氧化还原酶抑制剂电化学检测方法的构建NAD(P)H依赖的醌类氧化还原酶1(NQO1)是一种广泛分布的黄素蛋白,它以NADH或者NADPH为辅助因子,通过两电子的还原作用将醌类物质还原为相应的还原型醌。已有的研究发现,NQO1在人多种肿瘤中的表达均较高,因此NQO1成为抗肿瘤药物的潜在靶点。在论文本部分,我们利用NQO1底物,即醌类衍生物的电化学活性,通过巯基乙胺将该底物共价连接至电极表面,构建了一种检测NQO1酶活性的电化学方法。在优化的条件下,NQO1酶活性的检测范围为0.1至10 U/m L,检测限为0.22 U/m L。随后,我们利用所构建的电化学方法研究了白藜芦醇对NQO1的抑制作用,得到白藜芦醇对NQO1的最大抑制率为95%,半数抑制浓度为23.70μM。
【关键词】：酶 抑制剂 生化分析 生物传感 电化学分析 淀粉-果胶复合物 淀粉-可溶性膳食纤维复合物 木质素 α-淀粉酶 α-葡萄糖苷酶 二肽基肽酶IV 醌类氧化还原酶1
【学位授予单位】：上海大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q55
【目录】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-18
• 第一章 绪论18-50
• 1.1 酶及其反应抑制剂18-29
• 1.1.1 α-淀粉酶及其反应抑制剂18-21
• 1.1.2 α-葡萄糖苷酶及其反应抑制剂21-24
• 1.1.3 二肽基肽酶Ⅳ及其反应抑制剂24-27
• 1.1.4 醌氧化还原酶1及其反应抑制剂27-29
• 1.2 酶反应抑制剂的研究方法29-41
• 1.2.1 紫外光谱法29-30
• 1.2.2 荧光光谱法30-32
• 1.2.3 傅里叶变换红外光谱法32-33
• 1.2.4 圆二色谱法33-34
• 1.2.5 共振光散射法34-35
• 1.2.6 电化学方法35-41
• 1.3 本论文的主要研究内容41
• 1.4 参考文献41-50
• 第二章 淀粉-果胶复合物对 α-淀粉酶水解反应抑制作用的研究50-64
• 2.1 引言50-51
• 2.2 材料与方法51-54
• 2.2.1 试剂和仪器51-52
• 2.2.2 样品制备52
• 2.2.3 对 α-淀粉酶水解作用的影响52-53
• 2.2.4 X-射线衍射53
• 2.2.5 傅里叶变换红外光谱53
• 2.2.6 热力学分析53
• 2.2.7 抗性淀粉（RS）含量53-54
• 2.2.8 统计分析54
• 2.3 结果与讨论54-62
• 2.3.1 对酶水解作用的抵抗54-56
• 2.3.2 晶体特征56-57
• 2.3.3 热力学特性57-61
• 2.3.4 抗性淀粉含量61-62
• 2.4 结论62
• 2.5 参考文献62-64
• 第三章 淀粉-可溶性膳食纤维复合物对 α-淀粉酶水解反应抑制作用的研究64-81
• 3.1 引言64-65
• 3.2 材料与方法65-68
• 3.2.1 样品与试剂65-66
• 3.2.2 淀粉-SDF复合物制备66
• 3.2.3 对酶水解作用的影响66-67
• 3.2.4 X-射线衍射67
• 3.2.5 傅里叶变换红外光谱67
• 3.2.6 热力学分析67-68
• 3.2.7 统计分析68
• 3.3 结果与讨论68-78
• 3.3.1 对酶水解作用的抵抗68-69
• 3.3.2 结构特性69-73
• 3.3.3 热力学特性73-78
• 3.3.4 抗性淀粉-可溶性膳食纤维复合物形成机制78
• 3.4 结论78-79
• 3.5 参考文献79-81
• 第四章 木质素对 α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究81-103
• 4.1 引言81
• 4.2 材料与方法81-85
• 4.2.1 材料与试剂81-82
• 4.2.2 木质素对 α-葡萄糖苷酶的抑制作用82-83
• 4.2.3 荧光光谱83-84
• 4.2.4 圆二色光谱84
• 4.2.5 原子力显微镜84-85
• 4.2.6 统计分析85
• 4.3 结果与讨论85-100
• 4.3.1 木质素对 α-葡萄糖苷酶的抑制作用85-88
• 4.3.2 木质素与 α-葡萄糖苷酶的交互作用88-94
• 4.3.3 α-葡萄糖苷酶-木质素相互作用对 α-葡萄糖苷酶构象的影响94-97
• 4.3.4 木质素作用前后 α-葡萄糖苷酶的粒状特性97-99
• 4.3.5 α-葡萄糖苷酶与木质素相互作用的动力学研究99-100
• 4.4 结论100
• 4.5 参考文献100-103
• 第五章 二肽基肽酶IV抑制剂电化学检测方法的构建103-120
• 5.1 引言103-104
• 5.2 实验材料与方法104-107
• 5.2.1 材料与试剂104-106
• 5.2.2 巯基乙胺功能化的金纳米颗粒（CA-Au NPs）的合成106
• 5.2.3 电极表面的处理与修饰106-107
• 5.2.4 电极表面Fc-多肽的水解反应107
• 5.2.5 DPP-IV活性的抑制107
• 5.2.6 电化学检测107
• 5.3 结果与讨论107-117
• 5.3.1 金电极表面的电化学表征110-112
• 5.3.2 电极修饰及酶反应条件的优化112-114
• 5.3.3 DPP-IV活性的电化学检测114-115
• 5.3.4 抑制剂检测115-117
• 5.4 结论117
• 5.5 参考文献117-120
• 第六章 醌氧化还原酶抑制剂电化学检测方法的构建120-134
• 6.1 引言120-121
• 6.2 实验材料与方法121-124
• 6.2.1 材料与试剂121-123
• 6.2.2 金电极的修饰123
• 6.2.3 NQO1的还原作用123
• 6.2.4 白藜芦醇的抑制作用123-124
• 6.2.5 电化学检测124
• 6.3 结果与讨论124-130
• 6.3.1 修饰电极的电化学表征125-127
• 6.3.2 NQO1酶活性的电化学检测127-129
• 6.3.3 白藜芦醇的抑制作用129-130
• 6.4 结论130
• 6.5 参考文献130-134
• 总结和展望134-136
• 作者在攻读博士学位期间公开发表的论文136-138
• 致谢138

  本文关键词：若干酶反应抑制剂的研制及检测新方法的构建，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：329511