薇甘菊MmZFP1和MmTLPs在病害、干旱胁迫响应中的功能及调控研究

发布时间：2017-04-27 00:09

  本文关键词：薇甘菊MmZFP1和MmTLPs在病害、干旱胁迫响应中的功能及调控研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：植物体内基因表达的变化受到多种信号转导机制的调控,C2H2型锌指蛋白作为信号转导重要的转录因子在调控生物和非生物胁迫相关基因表达的过程中发挥着重要的作用,也成为植物抗逆分子机理研究的重要对象。基于薇甘菊对生物和非生物环境胁迫的耐受性和适应性,从薇甘菊中克隆了C2H2型锌指蛋白基因MmZFP1,并对其抗病、耐旱性进行了研究。另外,薇甘菊对植物病原菌的侵染有很强的抵抗力,为了进一步研究薇甘菊中抑菌蛋白及其基因的功能,从薇甘菊中分离了MmTLP1和MmTLP2,并对其功能进行了表征。论文研究结果如下： 1.C2H2型锌指蛋白是重要的转录因子家族,参与植物基因转录调节及逆境胁迫反应等生理过程。本论文从薇甘菊中克隆了C2H2型锌指蛋白基因MmZFP1,并对其功能进行了研究。研究表明,MmZFP1定位于细胞核,具有C2H2型锌指蛋白典型的结构特征。MmZFP1基因在根、茎、叶中均表达,在根中的表达水平高于茎和叶。在棉花黄萎病菌(Vd991)侵染以及SA、乙烯、ABA、脱水和高盐胁迫的诱导下,MmZFP1基因的表达水平显著上调。通过对转MmZFPl基因拟南芥的表型观察,发现组成型的表达MmZFP1导致转基因植株生长和发育受到抑制,抑制程度与MmZFP1基因的表达水平相关。转MmZFP1基因拟南芥显著提高了对番茄细菌性叶斑病和棉花黄萎病的抗性。在正常生长条件下的拟南芥和Vd991侵染的拟南芥植株,转MmZFP1基因拟南芥的PR1、 PR2等防卫基因的表达水平都显著上调。过表达MmZFP1基因能显著提高转基因拟南芥的抗旱能力,转MmZFPl基因拟南芥中ABF3、ABF4等干旱胁迫抗性基因的表达水平显著上调。上述结果表明,MmZFP1在植物病害和干旱胁迫的应答反应中发挥着重要作用。 2.从薇甘菊种子分离到具有抗苹果腐烂病菌的蛋白组分,运用蛋白组学方法对该组分进行分析,获得MmTLP14肽段序列。从薇甘菊中克隆了2个类甜蛋白基因MmTLP1和MmTLP2,并对其功能进行了研究。对MmTLP1和MmTLP2表达模式的研究表明,MmTLP1基因在薇甘菊的根、茎、叶中均有表达,MmTLP2基因在薇甘菊叶中的表达量高于根和茎。在Vd991侵染,外源激素SA, MeJA、乙烯、ABA、脱水和高盐胁迫的诱导下,MmTLP1基因的表达显著上调,而MmTLP2不受乙烯调控,受Vd991、SA、MeJA、ABA、脱水和高盐胁迫的诱导,MmTLP2表达水平升高。因此,MmTLP1和MmTLP2可能在薇甘菊对病原菌、干旱、高盐胁迫应答中发挥作用。亚细胞定位的研究表明,MmTLP1和MmTLP2定位于细胞壁或细胞外。分别纯化了原核表达的MmTLP1和MmTLP2的重组蛋白,都表现出一定的抗菌活性,能抑制苹果腐烂病菌、灰霉病菌、棉花枯萎病菌的菌丝生长。过表达MmTLP1基因显著提高了转基因拟南芥对Vd991侵染的抵抗能力,而转MmTLP2基因拟南芥仅在发病早期表现出对Vd991的抗性。这些结果表明了MmTLP1能够保护植物并减轻真菌病害对植物的侵害,在植物对抗病害的防卫反应中发挥作用。过表达MmTLP1、 MmTLP2基因能显著提高转基因拟南芥植株耐早、耐盐能力。结果表明,MmTLP1和MmTLP2在植物抵御干旱、高盐胁迫方面发挥着重要的作用。
【关键词】：薇甘菊 C_2H_2型锌指蛋白 TLPs 病害 干旱胁迫
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 缩写词6-7
• 目录7-10
• 第一章 绪论10-27
• 1.1 研究意义10-11
• 1.2 国内外研究现状11-26
• 1.2.1 入侵植物-薇甘菊的研究进展11-15
• 1.2.2 植物C_2H_2型锌指蛋白的研究进展15-19
• 1.2.3 类甜蛋白研究进展19-24
• 1.2.4 植物抗病机制研究进展24-26
• 1.3 研究内容和方法26-27
• 1.3.1 研究内容26
• 1.3.2 研究方法和技术路线26-27
• 第二章 薇甘菊MmZFP1在病害、干旱胁迫响应中的功能及调控研究27-63
• 2.1 引言27
• 2.2 材料与方法27-42
• 2.2.1 植物材料27
• 2.2.2 培养基27-28
• 2.2.3 病原菌材料28
• 2.2.4 MmZFP1基因的克隆28-34
• 2.2.5 PCR产物的回收、克隆及测序34-35
• 2.2.6 MmZFP1的序列比对及进化树分析35
• 2.2.7 植物表达载体的构建35-36
• 2.2.8 MmZFP1的亚细胞定位36-37
• 2.2.9 薇甘菊的生物与非生物胁迫处理37-38
• 2.2.10 根癌农杆菌介导转化拟南芥38-39
• 2.2.11 Real-time PCR检测基因表达量39-41
• 2.2.12 转基因拟南芥的细胞凋亡现象的观察41
• 2.2.13 转基因拟南芥抗病、耐旱性分析41-42
• 2.3 结果42-60
• 2.3.1 MmZFP1基因的克隆42-43
• 2.3.2 MmZFP1的序列分析43-44
• 2.3.3 MmZFP1的进化树分析44-46
• 2.3.4 MmZFP1的表达特征分析46-48
• 2.3.5 植物表达载体的构建及转基因拟南芥的筛选、鉴定48-49
• 2.3.6 MmZFP1的亚细胞定位49-50
• 2.3.7 MmZFP1对转基因植株生长发育的影响50-52
• 2.3.8 转MmZFP1基因植物的细胞程序性死亡检测52-53
• 2.3.9 转MmZFP1基因拟南芥防卫基因的表达分析53-54
• 2.3.10 MmZFP1的表达调控对病原菌Pst.DC3000的抗性54-55
• 2.3.11 转MmZFP1基因拟南芥抗棉花黄萎病55-57
• 2.3.12 转MmZFP1基因拟南芥的失水率实验57
• 2.3.13 转MmZFP1基因拟南芥的干旱胁迫实验57-58
• 2.3.14 MmZFP1正调控抗逆相关基因58-60
• 2.4 讨论60-63
• 第三章 薇甘菊MmTLPs在病害、干旱胁迫响应中的功能研究63-104
• 3.1 引言63
• 3.2 材料与方法63-70
• 3.2.1 植物和病原菌材料63
• 3.2.2 薇甘菊种子总蛋白的提取63
• 3.2.3 薇甘菊种子抗菌活性蛋白组分的获得63-64
• 3.2.4 MmTLP1和MmTLP2的克隆64-65
• 3.2.5 MmTLP1和MmTLP2的序列比对及进化树分析65
• 3.2.6 原核表达载体的构建65-66
• 3.2.7 pET-32a-MmTLP1和pET-32a-MmTLP2的原核表达66
• 3.2.8 pCold-MmTLP1和pCold-MmTLP2的原核表达66-67
• 3.2.9 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)67
• 3.2.10 MmTLP1和MmTLP2的三维结构预测67-68
• 3.2.11 植物表达载体的构建68
• 3.2.12 MmTLP1和MmTLP2的亚细胞定位68
• 3.2.13 薇甘菊的生物与非生物胁迫处理68
• 3.2.14 根癌农杆菌介导转化拟南芥68-69
• 3.2.15 转基因拟南芥的筛选鉴定69
• 3.2.16 Real-time PCR检测基因表达量69
• 3.2.17 转基因拟南芥抗病性分析69
• 3.2.18 转基因拟南芥耐旱性分析69-70
• 3.2.19 转基因拟南芥耐盐性分析70
• 3.3 结果70-101
• 3.3.1 薇甘菊抑菌蛋白的分离和鉴定70-71
• 3.3.2 MmTLP1基因的克隆71-73
• 3.3.3 MmTLP2基因的克隆73-76
• 3.3.4 MmTLP1和MmTLP2序列比对和分析76-77
• 3.3.5 MmTLP1和MmTLP2的进化树分析77-78
• 3.3.6 MmTLP1和MmTLP2的组织表达特异性78
• 3.3.7 MmTLP1和MmTLP2在薇甘菊中的表达特征分析78-81
• 3.3.8 MmTLP1和MmTLP2的亚细胞定位81-83
• 3.3.9 pET-22b-MmTLP1和pET-22b-MmTLP2原核表达载体的构建及转化83-84
• 3.3.10 pCold-MmTLP1和pCold-MmTLP2原核表达载体的构建及转化84-85
• 3.3.11 pET-32a-MmTLP1和pET-32a-MmTLP2原核表达载体的构建及转化85-87
• 3.3.12 pET-22b-MmTLP1和pET-22b-MmTLP2的原核表达87-90
• 3.3.13 pCold-MmTLP1和pCold-MmTLP2的原核表达90-91
• 3.3.14 pET-32a-MmTLP1和pET-32a-MmTLP2的原核表达91-92
• 3.3.15 重组MmTLP1和重组MmTLP2抑菌活性检测92-93
• 3.3.16 MmTLP1和MmTLP2蛋白的抗菌机制分析93-94
• 3.3.17 MmTLP1转基因株系的获得94-95
• 3.3.18 MmTLP2转基因株系的获得95-97
• 3.3.19 转基因株系目的基因表达量的检测97-98
• 3.3.20 转MmTLP1和MmTLP2基因拟南芥抗棉花黄萎病实验98-99
• 3.3.21 转MmTLP1和MmTLP2基因拟南芥的干旱胁迫试验99-100
• 3.3.22 转MmTLP1和MmTLP2基因拟南芥的失水率测试100
• 3.3.23 转MmTLP1和MmTLP2基因拟南芥的盐胁迫实验100-101
• 3.4 讨论101-104
• 第四章 结论104-107
• 4.1 薇甘菊MmZFP1在病害、干旱胁迫响应中的功能及调控研究104-105
• 4.2 薇甘菊MmTLPs在病害、干旱胁迫响应中的功能研究105-106
• 4.3 创新点106-107
• 参考文献107-120
• 致谢120-122
• 作者简介122

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 康洁;;植物细胞凋亡研究进展[J];安徽农业科学;2007年01期

2 郝彩琴;冯俊涛;张兴;;小花假泽兰提取物抑菌活性研究[J];安徽农业科学;2011年15期

3 郝彩琴;冷晓红;郭鸿雁;李军;;小花假泽兰化学成分及其生物活性研究进展[J];安徽农业科学;2011年25期

4 徐艳媚;廖周瑜;;国内对薇甘菊的研究综述[J];现代农业科技;2011年06期

5 李昀,沈禹颖,阎顺国;NaCl胁迫下5种牧草种子萌发的比较研究[J];草业科学;1997年02期

6 白晶;张必弦;李新玲;徐香玲;;野生大豆(Glycine soja)C2H2型锌指蛋白基因的克隆与序列分析[J];大豆科学;2009年01期

7 林翠新,廖庆文,曾丽梅;薇甘菊的研究综述[J];广西林业科学;2003年02期

8 宋冰;洪洋;王武;王贺;付永平;丁孝营;;植物C_2H_2型锌指蛋白的研究进展[J];基因组学与应用生物学;2010年06期

9 曾宪锋;;薇甘菊在赣南的首次详实记录[J];广东农业科学;2013年01期

10 张敏;韩雅莉;;薇甘菊叶的总黄酮提取及抑菌活性研究[J];广东工业大学学报;2014年02期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 庄世宏;小花假泽兰杀菌作用研究[D];西北农林科技大学;2010年

  本文关键词：薇甘菊MmZFP1和MmTLPs在病害、干旱胁迫响应中的功能及调控研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：329515