类受体激酶SOBIR1互作蛋白的鉴定及功能分析

发布时间：2017-04-29 14:08

  本文关键词：类受体激酶SOBIR1互作蛋白的鉴定及功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：植物通过位于细胞内或者细胞表面上的免疫受体来识别病原体分子并激活免疫反应。位于膜上的免疫受体主要分为类受体蛋白和类受体激酶两类,其中类受体激酶包括负责识别信号的胞外区,跨膜区及激活下游信号的胞内激酶区。与类受体激酶不同,类受体蛋白在胞内区只含有短的多肽,无激酶结构。番茄(Solanum lycopersicum)中抗叶霉菌(Cladosporium fulvum)蛋白Cfs为类受体蛋白,其如何传导下游信号,机理还不清楚。最近,本实验室发现类受体激酶SOBIR1可以与Cfs蛋白互作,沉默SOBIR1后减弱Cfs介导的过敏反应和抗病性,同时减少了Cf-4的积累和稳定。本实验室及其他研究者发现SOBIR1与大量的类受体蛋白结合,并且参与大量的类受体蛋白介导的下游信号。为了更好的了解类受体蛋白如何介导下游信号,以及SOBIR1在类受体蛋白复合体中的具体功能,本研究通过酵母杂交技术及免疫沉淀的方法鉴定SOBIR1的互作蛋白,构建TVR载体沉默候选基因,验证候选基因是否会对Cf-4/Avr4介导的过敏反应及抗性有影响。主要结果有:(1)通过对番茄Sl SOBIR1及拟南芥At SOBIR1结构进行预测,发现SOBIR1蛋白含有5个亮氨酸重复序列,1个跨膜区及胞内激酶区。通过比对SOBIR1同源蛋白序列发现胞内激酶区较胞外区保守,发现跨膜区Wxx Gxxx Gxxx G基序在多个SOBIR1同源蛋白中保守存在。(2)构建PGBKT7-Sl SOBIR1-Kinase载体,通过western blot实验证明SOBIR1激酶结构可以在酵母中表达。自激活实验及毒性检测证明SOBIR1激酶结构对酵母无自激活及无毒性。利用SOBIR1激酶结构对番茄cDNA文库进行酵母杂交筛库,发现基因VDAC及SAP18可能为SOBIR1互作蛋白的候选蛋白。(3)构建TRV-VDAC及TRV-SAP18载体分别沉默本式烟中VDAC及SAP18同源基因,发现沉默SAP18减弱了Cf-4/Avr4介导的过敏反应,而沉默VDAC对Cf-4/Avr4介导的过敏反应没有影响。进一步沉默番茄中SAP18同源基因,减弱了Cf-4介导的对叶霉病的抗性。在本式烟中共同表达VDAC及SOBIR1,免疫共沉淀实验发现VDAC不能与SOBIR1共同纯化出来。(4)对番茄转化载体35S:SOBIR1-e GFP或35S:FLS2-GFP,并通过PCR及western blot确认获得转基因番茄。比较转基因番茄表达SOBIR1-e GFP及转基因番茄超表达FLS2-GFP,发现SOBIR1转基因植株获得率低,且SOBIR1表达量低,超表达SOBIR1番茄表现植株矮小。(5)纯化Avr4蛋白,并通过稀释不同浓度梯度1000μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml及1μg/ml,发现浓度大于100μg/ml时能诱导番茄Moneymaker-Cf-4过敏反应。在转基因本式烟Cf-4中注射Avr4浓度为1000μg/ml,同样能诱导Cf-4介导的过敏反应,说明可以激活下游信号。(6)转基因番茄稳定表达SOBIR1-eGFP和拟南芥中稳定表达SOBIR1-YFP,并利用GFP affinity beads纯化SOBIR1。通过在烟草中瞬时表达SOBIR1-GFP,并利用Avr4蛋白进行处理,同时以水处理作为对照,利用GFP affinity beads纯化烟草叶片中总蛋白的SOBIR1-GFP。在烟草中瞬时表达SOBIR1激酶结构或者无激酶活性的SOBIR1激酶结构,利用GFP affinity beads纯化烟草叶片中总蛋白SOBIR1激酶结构-GFP。通过质谱对共沉淀的蛋白进行测序,最后选择了DRP2、PP2C、GB及STK作为候选基因。(7)构建不同TRV载体分别沉默本式烟中DRP2、PP2C、GB及STK同源基因,发现沉默STK减弱了Cf-4/Avr4介导的过敏反应,而沉默DRP2、PP2C及GB对Cf-4/Avr4介导的过敏反应没有影响。
【关键词】：番茄 类受体蛋白 类受体激酶 植物免疫 抗病信号 SOBIR1
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 1 前言12-26
• 1.1 研究目的意义、研究内容、实验设计12-14
• 1.1.1 本研究的目的意义12-13
• 1.1.2 研究内容13
• 1.1.3 试验设计13-14
• 1.2 文献综述14-26
• 1.2.1 番茄抗叶霉病的研究进展14-18
• 1.2.2 膜受体蛋白研究进展18-21
• 1.2.3 SOBIR1研究进展21-22
• 1.2.4 互作蛋白鉴定方法的研究进展22-26
• 2 材料与方法26-42
• 2.1 实验材料26
• 2.1.1 植物材料26
• 2.1.2 菌株和质粒26
• 2.2 方法26-36
• 2.2.1 植物的无菌培养与栽培26-27
• 2.2.2 载体构建的一般方法27-30
• 2.2.3 各种植物表达载体的构建30-31
• 2.2.4 酵母杂交筛选c DNA文库31-33
• 2.2.5 转基因植物获得33-34
• 2.2.6 植物总蛋白的提取及免疫印迹共沉淀34-35
• 2.2.7 质谱样品制备35
• 2.2.8 总RNA的提取35-36
• 2.2.9 HR检测和Cladosporium fulvum接种测定36
• 2.3 试剂及缓冲液配方36-42
• 2.3.1 常用分子生物学试剂配方36-38
• 2.3.2 常用缓冲液配方38-39
• 2.3.3 常用培养基配方39-42
• 3 结果与分析42-75
• 3.1 SOBIR1蛋白序列分析42-44
• 3.1.1 SOBIR1蛋白进化树分析42
• 3.1.2 SOBIR1蛋白结构域分析42-43
• 3.1.3 SOBIR1同源蛋白跨膜区分析43-44
• 3.2 通过酵母杂交技术鉴定Sl SOBIR1互作蛋白44-50
• 3.2.1 酵母能稳定表达Sl SOBIR1-kinase domain(KD)和Sl SOBIR1-RD/ N-kinase domain44-45
• 3.2.2 自激活检测45-46
• 3.2.3 毒性检测46-47
• 3.2.4 酵母杂交效率检测47
• 3.2.5 PCR及酶切筛选重复序列47
• 3.2.6 测序结果47-49
• 3.2.7 酵母共转化49-50
• 3.2.8 候选基因功能预测50
• 3.3 酵母杂交候选基因功能验证50-53
• 3.3.1 VDAC功能验证50-52
• 3.3.2 SAP18功能验证52-53
• 3.4 通过质谱技术鉴定SlSOBIR1互作蛋白53-70
• 3.4.1 植物材料准备53-58
• 3.4.2 质谱样品准备58-62
• 3.4.3 质谱结果与分析62-68
• 3.4.4 候选基因生物信息学分析68-70
• 3.5 质谱候选基因功能验证70-75
• 3.5.1 候选基因表达量分析70-71
• 3.5.2 功能验证71-75
• 4 讨论75-81
• 4.1 SOBIR1进化保守75-76
• 4.2 酵母杂交及免疫沉淀假阳性76-77
• 4.3 SOBIR1自激活77-78
• 4.4 SOBIR1下游途径78
• 4.5 假阳性基因功能讨论78-79
• 4.6 主要创新点79
• 4.7 今后研究的方向与目标79-81
• 5 结论81-82
• 致谢82-83
• 参考文献83-94
• 攻读博士学位期间发表的学术论文94

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