猪核移植重编程关键母源因子的筛选及功能研究

发布时间：2021-08-22 06:55

　　体细胞核移植技术在许多方面都有很大的应用前景,但目前核移植效率还普遍很低,人们对核移植重编程机制了解的也还不够全面。对母源因子的挖掘和研究可以增加人们对核移植重编程机制的认识,进而会提高核移植效率,促进核移植技术更广泛的应用。近几年来随着蛋白质组技术的发展,人们已经发现了许多卵中的母源蛋白,但如何从众多的母源因子中筛选出对胚胎发育,特别是对核移植重编程,有特殊作用的蛋白因子成为现在人们着重希望解决的问题。在前期工作中,我们发现大部分的猪体外成熟培养33 h的卵母细胞（33O）已经达到了核成熟,然而其核移植之后的克隆胚胎发育率却显著低于一般猪核移植所用的42h的成熟卵（42O）。这可能是因为42O中含有更多的有利于核移植重编程的母源因子,这就为我们针对性的挖掘对细胞重编程和早期胚胎发育起重要作用的母源因子提供了一个契机。在本研究中,我们拟通过对猪33O和42O的蛋白质组进行比较,发现33O和42O之间差异表达的蛋白,并试图从中发现一些与核移植重编程有关的母源因子,从而希望增加人们对核移植重编程机制的了解。主要研究结果如下:（1）首先我们利用定量蛋白质组学的经典技术路线——2D-PAGE+... 

【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校

【文章页数】：68 页

【学位级别】：博士

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摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 核移植简述
    1.2 核移植重编程机制
    1.3 母源因子与核移植重编程
    1.4 本研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 主要仪器设备
        2.1.3 主要试剂及配置
        2.1.4 主要生物信息学分析软件及数据库
    2.2 实验方法
        2.2.1 33O和42O蛋白样品制备
        2.2.2 蛋白质分析胶电泳及图像分析
        2.2.3 蛋白质制备胶电泳及质谱鉴定分析
        2.2.4 生物信息学分析
        2.2.5 Western blot
        2.2.6 体外胚胎操作（SCNT，PA，IVF）
        2.2.7 实时定量PCR
        2.2.8 免疫荧光检测
        2.2.9 iPS细胞诱导
        2.2.10 碱性磷酸酶染色
        2.2.11 GSK126和GSK-J4药物处理
        2.2.12数据分析
3 结果与分析
    3.1 猪不同成熟时间MII期卵母细胞的差异蛋白谱的构建
        3.1.1 猪体外成熟培养33h和42h的MII期卵母细胞的收集
        3.1.2 330和42O的差异蛋白的分离
        3.1.3 330和42O的差异蛋白的鉴定
        3.1.4 33O和42O的差异蛋白的生物信息学分析
    3.2 母源VIM蛋白在猪核移植重编程中的功能研究
        3.2.1 VIM在猪IVF和NT胚胎中的表达模式
        3.2.2 干扰母源VIM对猪克隆胚胎发育的影响
        3.2.3 母源VIM在核移植重编程中防止基因组损伤
    3.3 母源EZH2蛋白在猪核移植重编程中的功能研究
        3.3.1 干扰母源EZH2蛋白能够提高猪克隆胚胎发育率
        3.3.2 猪早期克隆胚胎的H3K27me3水平高于IVF胚胎
        3.3.3 降低供体细胞PEF的H3K27me3水平能够提高克隆胚胎的发育率
        3.3.4 降低早期胚胎中的H3K27me3水平能够提高克隆胚胎的发育率
        3.3.5 在源头细胞或早期重编程过程中降低H3K27me3水平能够提高iPS诱导效率
4 讨论
    4.1 33O和42O之间蛋白质组的差异
    4.2 母源VIM在猪核移植重编程中的功能
    4.3 H3K27me3水平对猪克隆胚胎发育的影响
5 结论
致谢
参考文献
攻读博士学位期间发表的学术论文



本文编号：3357240