定量聚合酶链式反应荧光检测技术研究

发布时间：2017-05-03 00:10

  本文关键词：定量聚合酶链式反应荧光检测技术研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：定量聚合酶链式反应(Q-PCR, Quantitative Polymerase Chain Reaction)技术是基于荧光共振能量转移(FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer)的原理,在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测PCR进程中每个反应循环扩增产物量的变化,最后通过标准曲线对起始模板数进行定量分析的技术。为实现扩增模板的准确定量,需要严格控制PCR试剂的反应时间和反应温度；还需要对反应过程中试剂发出的荧光信号进行准确的定量分析,包括能检测到微安级微弱信号的光学系统和实现荧光数据定量描述的荧光信号监测系统。定量聚合酶链式反应系统包括实现目标基因快速扩增的热循环系统和实现目标基因准确定量的荧光检测系统。其中用于检测荧光信号的光学系统,是实现扩增产物定量检测的核心元件。基于传统的共聚焦式荧光检测光路,本文提出了Y光纤型光学系统。该系统利用光纤的全反射原理,通过将激发光以全反射的形式引入Y光纤激发分支并激发荧光试剂发出荧光,再由光纤的发射分支接收荧光信号送至光电转换器,由于没有引入过多的传统光学器件,因此大大降低了光线在传输过程中能量的损耗。通过光学软件ZEMAX仿真对影响Y光纤型光学系统传输效率的影响因素进行了分析,包括光源、透镜参数、光纤数值孔径和光纤损耗等；并结合实际荧光检测实验,对比基于共聚焦式和基于Y型光纤的荧光检测系统检测结果,验证了Y光纤型光学系统的有效性。该光学系统对96孔样品块进行扫描式检测,为避免光学系统与热循环系统在结构上的相互干涉,本文采用相互正交的双螺杆电动台分别带动光学模块和热循环模块作直线运动以完成荧光的激发和收集过程。由光学系统捕捉到的荧光数据非常微弱,一般处于微安量级,并掺杂有噪声信号,因此在将模拟信号转换成数字信号之前需要对采集到的荧光数据进行放大滤波处理,再通过数据采集卡对处理得到的模拟电压信号进行A/D转换送至上位计算机的数据处理系统。为完成扩增模板的准确定量,数据处理系统需要对数据进行数字滤波处理以进一步去除信号中的噪声干扰,并通过五点三次数据平滑处理提高曲线拟合效果,最后按照加载的定量算法求得目标基因在各个循环的扩增量和起始拷贝数从而实现扩增片段的定量检测。基于Liu Saint S型曲线模型,提出了改进型定量算法,该算法考虑了聚合酶链式反应过程中每个循环扩增效率的动态性能,因此对荧光数据进行拟合分析更为科学客观。通过使用本课题所研发的定量聚合酶链式反应系统进行荧光检测和基因定量实验可以得出,采用Y型光纤光学系统可以有效提高系统荧光检测灵敏度,采用改进型定量算法拟合荧光数据可有效提高定量结果的重复性和可靠性。
【关键词】：定量聚合酶链式反应 Y型光纤 耦合效率 荧光检测 基因定量算法
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q503
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 第一章 绪论12-32
• 1.1 课题背景12-24
• 1.1.1 PCR技术简史12-13
• 1.1.2 PCR技术概论13-14
• 1.1.3 PCR技术基本原理14-16
• 1.1.4 荧光定量PCR技术简史16
• 1.1.5 荧光定量PCR技术概论16-21
• 1.1.6 荧光定量PCR数学原理21-24
• 1.2 荧光定量PCR系统及国内外发展趋势24-28
• 1.2.1 荧光定量PCR系统24-26
• 1.2.2 国内外发展趋势26-28
• 1.3 课题研究意义28-29
• 1.4 研究内容及章节安排29-32
• 第二章 荧光检测光学系统设计与仿真分析32-56
• 2.1 荧光检测光学系统设计32-48
• 2.1.1 光学系统设计34-43
• 2.1.2 光纤理论43-48
• 2.2 光学系统仿真分析48-56
• 2.2.1 光学系统搭建48-52
• 2.2.2 耦合效率影响因素分析52-54
• 2.2.3 光学系统性能研究54-56
• 第三章 荧光信号监测系统设计与实现56-72
• 3.1 放大与滤波电路设计56-64
• 3.1.1 I-V转换前置放大电路设计57-59
• 3.1.2 二次放大电路设计59-60
• 3.1.3 滤波电路设计60-64
• 3.2 数字处理系统设计与实现64-69
• 3.2.1 运动控制子系统65-67
• 3.2.2 数字信号处理子系统67-69
• 3.3 荧光信号监测系统性能分析69-72
• 第四章 荧光定量算法设计72-96
• 4.1 荧光定量算法简介73-84
• 4.1.1 双标准曲线法75-76
• 4.1.2 2~(-△△ct)法76-79
• 4.1.3 Pfaffl算法79-80
• 4.1.4 S型曲线法80-84
• 4.2 改进型定量算法84-91
• 4.3 改进型定量算法性能研究91-96
• 第五章 系统实验研究96-108
• 5.1 实验方案97-100
• 5.2 数据分析100-108
• 第六章 总结与展望108-112
• 6.1 论文总结108-110
• 6.2 课题展望110-112
• 参考文献112-122
• 科研成果122

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 王宇华,李志华,段发阶,叶声华;光纤耦合效率与接收光强计算研究[J];光电工程;2005年07期

2 袁纵横;胡放荣;;基于ZEMAX软件设计的半导体激光无源光纤耦合系统[J];红外与激光工程;2006年S5期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 黄靖;定量聚合酶链反应热循环系统及荧光检测技术研究[D];浙江大学;2012年

  本文关键词：定量聚合酶链式反应荧光检测技术研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：341978