多拷贝人/鲑嵌合降钙素在酿酒酵母中表达优化及安全性评价研究

发布时间：2021-10-14 16:26

　　降钙素（Calcitonin, CT）是由32个氨基酸残基组成的多肽类激素,在体内的主要作用是通过抑制破骨细胞活性,减少骨质吸收,促进钙在骨中的沉积,从而降低血钙浓度,被广泛的使用于治疗Paget综合症,骨质疏松和高钙血症。研究表明,冻干的酵母作为多肽类药物载体可以抵抗蛋白酶降解能力,降钙素能够以多肽的形式直接穿过动物胃肠道的表皮细胞进入血液。因此,本实验室的孙平楠和姜勇等人前期分别构建了两个不同的转鲑鱼降钙素基因酵母yAGA2-sCT和yAGA2-r-sCT,均成功实现了鲑鱼降钙素的口服给药。为了进一步提高降钙素的表达量和生物活性,本研究将5拷贝人／鲑嵌合降钙素基因（5hsCT）,以rDNA作为同源重组位点多拷贝整合到酿酒酵母基因组中,并对其的表达条件和培养条件进行了优化,通过动物毒理学实验对其进行了安全性评价,为实现口服降钙素药物生产应用提供实验基础。本研究通过Hpal酶切表达载体pUC 18-rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA 1获得线性rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNAI片段,以rDNA为同源重组位点将ura3标记基因和带有磷酸甘油酸激酶启动... 

【文章来源】：中国海洋大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：210 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述和立项依据
    第一节 降钙素的研究概况
        1 降钙素的来源
            1.1 降钙素的发现
            1.2 降钙素的生产
        2 降钙素的生物特性
            2.1 生物活性
            2.2 降钙素的分子结构与生物活性的关系
        3 hsCT分子的概况
            3.1 hsCT的分子结构
            3.2 hsCT的等电点pI值、亲水性和疏水性分析
            3.3 hsCT的抗原表位
        4 降钙素的研究展望
    第二节 酿酒酵母rDNA的结构及其介导整合影响因素的研究进展
        1 酿酒酵母同源重组研究概况
        2 rDNA作为酿酒酵母同源重组位点的研究
        3 酿酒酵母rDNA序列元件组成及功能
            3.1 rDNA序列组成元件及功能
            3.2 rDNA序列35S启动子组成元件及功能
        4 影响酿酒酵母rDNA的因素
            4.1 影响rDNA的重要功能元件
            4.2 酿酒酵母rDNA重复单元拷贝数的影响因素
            4.3 酿酒酵母rDNA重复单元稳定性的影响因素
            4.4 以rDNA高拷贝数整合的外源基因在有丝分裂中稳定性的影响因素
        5 展望
    第三节 转基因食品的安全性评价研究
        1 转基因食品的概况
        2 转基因食品的安全问题
        3 转基因食品的安全性评价
            3.1 营养评价
            3.2 致敏性检测
            3.3 毒理学评价
        4 食品安全性评价的应用
            4.1 食品安全性评价在转基因动物中的应用
            4.2 食品安全性评价在转基因植物中的应用
            4.3 食品安全性评价在转基因微藻中的应用
            4.4 食品安全性评价在转基因酵母中的应用
    第四节 立项依据
        1 5hsCT基因的构建及表达研究
        2 以rDNA介导降钙素基因在酿酒酵母中的表达
        3 人/鲑嵌合降钙素串联基因在酿酒酵母中表达
第二章 转5hsCT基因酿酒酵母的检测分析
    第一节 5hsCT基因向酿酒酵母的转化和检测
        1 前言
        2 材料
            2.1 质粒和菌株
            2.2 培养基
            2.3 常用试剂
            2.4 主要仪器设备
        3 方法
            3.1 rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1线性片段的获得
            3.2 酿酒酵母感受态细胞的制备
            3.3 酿酒酵母的转化操作
            3.4 转化子的筛选和遗传稳定性检测
            3.5 提取转基因酿酒酵母基因组DNA
            3.6 Southern blotting实验
        4 结果
            4.1 rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1线性片段的获得
            4.2 酿酒酵母转化子的筛选和稳定性检测
            4.3 酿酒酵母转化子的Southem blotting检测
        5 讨论
            5.1 各种因素对转化率的影响
            5.2 转化子稳定性的影响因素
            5.3 Southern blotting检测
    第二节 人/鲑嵌合降钙素在酿酒酵母中表达的定性和定量分析
        1 前言
        2 材料
            2.1 菌种
            2.2 溶液及试剂
            2.3 实验仪器
        3 方法
            3.1 转基因酿酒酵母的培养
            3.2 酿酒酵母总蛋白的提取
            3.3 可溶性总蛋白质含量的测定
            3.4 SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳
            3.5 Western Blotting
            3.6 免疫检测
            3.7 酶联免疫吸附测定
        4 结果
            4.1 转基因酿酒酵母YS-5hsCT总蛋白含量的测定
            4.2 人/鲑嵌合降钙素的表达与定性分析
            4.3 人/鲑嵌合降钙素的表达与定量分析
        5 讨论
            5.1 Western blotting结果分析
            5.2 ELISA结果分析
    第三节 转基因酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠的降血钙活性研究
        1 前言
        2 材料
            2.1 实验动物
            2.2 实验菌株
            2.3 培养基
            2.4 常用实验仪器
        3 方法
            3.1 酿酒酵母的培养
            3.2 转基因酿酒酵母的收集
            3.3 动物实验设计
            3.4 小鼠取血和血清的制备
            3.5 血钙值的检测
            3.6 统计方法
        4 结果
            4.1 转基因酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠状态的影响
            4.2 小鼠血钙值的数据处理
            4.3 转基因酿酒酵母YS-5hsCT的持续降血钙活性
            4.4 剂量效应
        5 讨论
            5.1 真空冷冻干燥对转基因酿酒酵母的影响
            5.2 取血方法对血清的影响
            5.3 转基因酿酒酵母的降血钙活性效果
第三章 5hsCT在转基因酿酒酵母YS-5hsCT中表达条件的优化
    第一节 不同条件对5hsCT基因在转基因酿酒酵母YS-5hsCT中表达的影响
        1 前言
        2 材料
            2.1 菌株与培养基
            2.2 主要试剂
            2.4 主要仪器
        3 方法
            3.1 转基因酿酒酵母种子液的培养
            3.2 转基因酿酒酵母培养的时间梯度设置
            3.3 转基因酿酒酵母培养的温度梯度设置
            3.4 转基因酿酒酵母培养的转速梯度设置
            3.5 酿酒酵母总RNA的提取
            3.7 Real-time PCR
            3.8 基因相对表达量的数据处理
            3.9 酵母总蛋白的提取
            3.10 可溶性总蛋白质含量的测定
            3.11 SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳
            3.12 酶联免疫吸附测定
        4 结果与分析
            4.1 不同条件处理后酿酒酵母总RNA的提取
            4.2 Real-time PCR反应
            4.3 不同条件下5hsCT在酿酒酵母中表达的SDS-PAGE分析
            4.4 不同条件下人/鲑嵌合降钙素的ELISA测定
        5 讨论
            5.1 反转录反应对Realtime PCR的影响因素
            5.2 不同条件对5hsCT基因在酿酒酵母中表达的影响
    第二节 单因子实验对转基因酿酒酵母YS-5hsCT培养条件的优化
        1 前言
        2 材料
            2.1 菌株与培养基
            2.2 实验试剂
            2.3 主要仪器
        3 方法
            3.1 种子液的制备
            3.2 接种量和发酵时间对转基因酿酒酵母生长的影响
            3.3 温度对转基因酿酒酵母生长的影响
            3.4 搅拌转速对转基因酿酒酵母生长的影响
            3.5 通气比对转基因酿酒酵母生长的影响
            3.6 酵母细胞密度及比生长速率的测定
            3.7 酵母生物量的测定
        4 结果与分析
            4.1 发酵时间对转基因酿酒酵母YS-5hsCT生长的影响
            4.2 接种量对转基因酿酒酵母生长的影响
            4.3 温度对转基因酿酒酵母生长的影响
            4.4 搅拌转速对转基因酿酒酵母生长的影响
            4.5 通气量对转基因酿酒酵母生长的影响
        5 讨论
            5.1 发酵时间和初始接种量对转基因酿酒酵母生长的影响
            5.2 发酵温度对转基因酿酒酵母生长的影响
            5.3 发酵搅拌速度和通气量对转基因酿酒酵母生长的影响
    第三节 正交实验设计对5hsCT在酿酒酵母YS-5hsCT中表达条件的综合优化
        1 前言
        2 材料
            2.1 菌株和培养基
            2.2 常用仪器
        3 方法
            3.1 种子液的制备
            3.2 正交实验设计
            3.3 酵母总蛋白的提取
            3.4 可溶性总蛋白质含量的测定
            3.5 SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳
            3.6 酶联免疫吸附测定
            3.7 酵母生物量的测定
        4 结果与分析
            4.1 正交实验中5hsCT蛋白表达的SDS-PAGE结果分析
            4.2 正交实验中5hsCT蛋白产量的结果分析
        5 讨论
第四章 小鼠口服转基因酿酒酵母YS-5hsCT的安全性评价
    第一节 转基因酿酒酵母YS-5hsCT经口急性毒性实验
        1 前言
        2 材料
            2.1 实验动物
            2.2 动物饲料
            2.3 菌株
        3 方法
            3.1 实验分组
            3.2 实验记录
            3.3 LDso的计算公式
        4 结果
        5 讨论
    第二节 转基因酿酒酵母YS-5hsCT的致突变作用研究Ⅰ
        1 前言
        2 材料
            2.1 实验动物、饲料和菌株
            2.2 主要试剂
            2.3 主要仪器
        3 方法
            3.1 实验分组
            3.2 制作小鼠骨髓细胞涂片
            3.3 涂片镜检
            3.4 统计学分析
        4 结果
        5 讨论
    第三节 转基因酿酒酵母的致突变作用研究Ⅱ
        1 前言
        2 材料
            2.1 动物、饲料和菌株
            2.2 主要试剂
            2.3 主要仪器
        3 方法
            3.1 实验分组
            3.2 制作小鼠精子涂片
            3.3 精子畸形检查
            3.4 统计学分析
        4 结果
            4.1 酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠精子畸形的诱导作用
            4.2 小鼠精子的畸形类型检查
        5 讨论
    第四节 转基因酿酒酵母YS-5hsCT的致畸变作用研究
        1 前言
        2 材料
            2.1 动物、饲料和菌株
            2.2 主要试剂
            2.3 主要仪器
        3 方法
            3.1 实验分组
            3.2 孕鼠的生殖机能检查
            3.3 胎鼠的外观检查
            3.4 胎鼠骨骼标本的制作与检查
            3.5 胎鼠内脏的畸形检查
            3.6 数据统计和分析
        4 结果
            4.1 转基因酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠的母体毒性
            4.2 转基因酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠的胚胎发育毒性
            4.3 转基因酿酒酵母YS-5hsCT对胎鼠外观的致畸影响
            4.4 转基因酿酒酵母YS-5hsCT对胎鼠骨骼的致畸影响
            4.5 转基因酿酒酵母YS-5hsCT对胎鼠各器官、内脏的致畸影响
        5 讨论
    第五节 转基因酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠的30天喂养实验研究
        1 前言
        2 材料
            2.1 动物、饲料和菌株
            2.2 主要试剂
            2.3 主要仪器
        3 方法
            3.1 实验分组
            3.2 血液学和血液生化检查
            3.3 病理组织学检查
            3.4 冰冻切片的制备
            3.5 冰冻切片的苏木素伊红染色
            3.6 统计学分析
        4 结果
            4.1 一般观察
            4.2 酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠体重的影响
            4.3 酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠血液常规指标的影响
            4.4 酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠血液生化指标的影响
            4.5 酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠脏器系数的影响
            4.6 病理组织检查
        5 讨论
            5.1 血常规和血液生化检测
            5.2 体重变化和脏器系数的影响
        6 小结
总结
参考文献
致谢
个人简历
发表的学术论文情况


【参考文献】：
期刊论文
[1]转基因食品安全性评价研究进展[J]. 宋欢,王坤立,许文涛,贺晓云,罗云波,黄昆仑.  食品科学. 2014(15)
[2]转基因玉米安全性评价研究进展[J]. 左娇,郭运玲,孔华,徐林,周霞,郭安平.  玉米科学. 2014(01)
[3]转基因大豆安全性评价的研究进展[J]. 左娇,郭运玲,孔华,徐林,周霞,郭安平.  热带作物学报. 2013(07)
[4]ScINO1基因克隆及酵母多基因多拷贝整合表达载体的构建[J]. 黄贞杰,陈玲,张积森,叶冰莹,陈由强,陈如凯.  福建师范大学学报(自然科学版). 2012(06)
[5]环磷酰胺对长爪沙鼠精子畸形的影响[J]. 杨僖,陈耿喆,何秉嘉,梁坤,梁成结,魏莲.  中国比较医学杂志. 2012(01)
[6]SPF级Balb/c小鼠脏器质量、脏器系数、血常规、血生化指标的测定与比较[J]. 张修彦,詹纯列,肖育华,唐咸国.  中国组织工程研究与临床康复. 2011(41)
[7]短小芽孢杆菌C-9葡聚糖内切酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达[J]. 杨金莹,吕建仁,党宏月.  中国石油大学学报(自然科学版). 2011(03)
[8]rDNA介导的酿酒酵母稳定表达载体的构建[J]. 张桂敏,曾毓芳,陈雅兰,屠俊,何家亨,马立新.  菌物学报. 2011(01)
[9]核糖体RNA基因在酵母分类鉴定中的应用[J]. 刘宁,刘延琳.  中国农业科学. 2010(22)
[10]NIH小鼠脏器重量和脏器系数的测定[J]. 詹纯列,肖育华,许达,唐咸国,邢超,莫子艺.  西南国防医药. 2010(09)

博士论文
[1]酵母表达鲑鱼降钙素基因载体的构建及相关研究[D]. 孙平楠.中国海洋大学 2007
[2]嵌合降钙素基因的构建及表达[D]. 王玉梅.中国海洋大学 2005
[3]主要商业化转基因产品标准化检测技术的建立与应用[D]. 潘良文.南京农业大学 2004

硕士论文
[1]丙烯酰胺对雄性小鼠生殖系统毒性的研究[D]. 谢南.吉林大学 2007



本文编号：3436472