LeMAPKs A类基因在番茄花柄外植体脱落中的作用研究

发布时间：2017-05-04 06:13

  本文关键词：LeMAPKs A类基因在番茄花柄外植体脱落中的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：植物器官脱落是植物应对外界环境(如干旱、盐胁迫、病虫害等)或放弃那些不再重要意义的器官的有效机制。植物体内形成了复杂而精确的信号转导机制调控花器官的脱落。其中模式生物拟南芥的花器官脱落的途径研究最为深入,其信号传递过程如下：BoP→AtIDA→AtHAESA→AtMKKK?→AtMKK4/MKK5→AtMPK3/MPK6→花器官脱落。其中MAPK级联信号起到了整合外界环境信号和植物体内激素信号的作用,从而在调控器官脱落方面起到重要作用。但此MAPK级联信号系统在番茄(茄科作物中的模式生物)花柄脱落中的作用尚不清楚,探究其调控花器官脱落机理对于理解脱落发生机制以及制定防止脱落措施具有重要的实践和理论意义。本研究主要结果如下：1.明确了LeMAPK家族A类基因参与番茄花器官脱落构建了拟南芥MAPK和番茄MAPK系统进化发育树。通过比较发现：参加拟南芥花器官脱落信号转导的AtMAPK3与LeMAPK 1,LeMAPK2；AtMAPK6和LeMAPK3遗传距离最近,同属于MAPK家族的A类。因此初步选择LeMAPK1,LeMAPK2, LeMAPK3为研究对象,开展后续番茄花器官脱落的相关研究工作。自然条件下,在番茄花柄外植体脱落过程中LeMAPKI和LeMAPK2表达量都呈现上升趋势；加钙处理能够降低脱落率,该条件下LeMAPKi和LeMAPK2基因表达的上升趋势得到一定程度的抑制。LeMAPK3基因在番茄花柄外植体脱落过程中表达量没有明显的上调表达,只在脱落的后期有小幅变化。在盐胁迫条件下,LeMAPK1/2基因在脱落的前期(12小时)起作用,而LeMAPK3在脱落期(24小时)作用。以上结果表明MAPK级联途径成员在番茄花柄外植体的脱落过程中表达模式不同,推测其在不同脱落阶段各自发挥作用。2.MAPK级联调节番茄花器官脱落与内源激素和细胞壁降解酶有关使用MAPK激酶阻断剂(MBA)对MAPK级联参与番茄花器官脱落的机制进行了探讨。MAPK阻断剂的施加减缓了脱落发生速度,脱落速度显著小于对照组。进一步研究发现,阻断剂对番茄花柄脱落过程中不同部位(远轴端,离区和近轴端)激素水平的改变造成了影响,降低了脱落酸的含量、提高生长素的含量,而对赤霉素的调控相对较为复杂,呈现波动变化的模式。阻断剂对细胞壁降解酶活性产生了影响,花柄离区和远轴端纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶(CMC、PG矛口PE)酶活力都被高度抑制,而对于花柄近轴端影响较小。以上研究说明MAPK对花器官脱落的影响可能是通过内源激素含量和细胞壁降解酶活性变化进行调节。3.MAPK阻断剂对乙烯诱导的花器官脱落产生抑制作用乙烯能够直接诱导番茄花柄外植体的脱落。研究发现,乙烯条件下使用MAPK阻断剂共同作用,可以降低乙烯加速花柄脱落的速度,该处理条件下激素和细胞壁降解酶活性的变化均处于阻断剂和乙烯处理之间,说明阻断剂能够介入乙烯信号通路,影响了乙烯对花柄脱落的促进作用。乙烯信号转导受到MAPK阻断剂的影响,推测在番茄花器官脱落过程中,乙烯和MAPK两个信号途径可能存在交叉,具体作用机制还有待进一步研究。4.LeMAPKs A基因的遗传转化明确LeMAPK1正调控花柄脱落以番茄Micro-Tom作为转基因材料,确定了最佳番茄愈伤组织和不定芽形成培养基条件为：MS基本培养基+2.0mg/L玉米素+0.5 mg/L吲哚乙酸+3%蔗糖；诱导不定芽生根的理想培养基为1/2 MS基本培养基+1.5%蔗糖+0.2 mg/L吲哚丁酸。同时以pBI121为表达载体,研究了转化细胞对卡那霉素(Kan)的敏感性,确定了最佳不定芽抗性筛选浓度为100 mg/L卡那霉素。为进一步研究LeMA4PK1,2和3在番茄花柄外植体脱落中的作用。构建了过表达载体pBI121-LeMAPK1,pBI121-LeMAPK2和pBI121-LeMAPK3,经农杆菌EHA105介导成功转入番茄中,获得了LeMAPK1和LeMAPK2过表达植株,植株中LeMAPK1和LeMAPK2相对表达量有了显著提高,分别有2.3和2.5倍的增长。LeMAPK1超表达植株表现出花柄脱落的表型。
【关键词】：番茄 器官脱落 MAPK 乙烯
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要12-14
• Abstract14-16
• 第一章 前言16-30
• 1.1 植物器官脱落16-17
• 1.1.1 营养失衡导致发生生理脱落16
• 1.1.2 逆境导致植物发生器官的胁迫脱落16-17
• 1.2 植物器官脱落与激素调控17-21
• 1.2.1 生长素类激素对脱落的影响17-18
• 1.2.2 乙烯与植物器官脱落18-20
• 1.2.3 植物器官脱落与其它内源激素调控20-21
• 1.3 影响植物离区形成的基因及脱落的信号转导21-23
• 1.4 植物中的MAPK级联系统23-27
• 1.4.1 MAPK的分类及特点23-24
• 1.4.2 MAPK参与生物胁迫反应24
• 1.4.3 MAPK参与非生物胁迫反应24-25
• 1.4.4 番茄MAPK的研究进展25-26
• 1.4.5 植物MAPK与乙烯26-27
• 1.5 植物器官脱落过程中相关酶类的研究27-29
• 1.5.1 纤维素酶27-28
• 1.5.2 多聚半乳糖醛酸酶28
• 1.5.3 其它相关酶与脱落的关系28-29
• 1.6 本研究的意义及内容29-30
• 第二章 LeMAPKs对花柄外植体脱落的响应30-43
• 2.1 材料与方法30-35
• 2.1.1 试验材料30-31
• 2.1.2 试验处理31
• 2.1.3 主要试剂和药品31
• 2.1.4 主要仪器31-32
• 2.1.5 番茄和拟南芥MAPK进化树构建32
• 2.1.6 番茄花柄外植体脱落率调查方法32
• 2.1.7 LeMAPKs A引物设计32
• 2.1.8 番茄花柄外植体总RNA的提取32-33
• 2.1.9 RNA纯度检测33-34
• 2.1.10 反转录(合成第一条cDNA链)34
• 2.1.11 实时定量PCR体系34-35
• 2.1.12 数据统计分析35
• 2.2 结果与分析35-41
• 2.2.1 LeMAPKs家族基因信息收集和整理35-36
• 2.2.2 番茄和拟南芥MAPK系统发育进化树构建36-37
• 2.2.3 番茄花柄外植体脱落进程分析37
• 2.2.4 引物的设计37-38
• 2.2.5 番茄总RNA提取结果38
• 2.2.6 在番茄花柄外植体脱落中LeMAPK1基因相对表达量的变化38-39
• 2.2.7 在番茄花柄外植体脱落中LeMAPK2基因相对表达量的变化39-40
• 2.2.8 在番茄花柄外植体脱落中LeMAPK3基因相对表达量的变化40
• 2.2.9 盐胁迫下番茄花柄外植体脱落中LeMAPKs A基因表达的变化40-41
• 2.3 本章小结41-43
• 第三章 LeMAPKs A参与花器官脱落作用机制43-60
• 3.1 材料与方法43-47
• 3.1.1 试验材料43
• 3.1.2 番茄花柄外植体处理方式43-44
• 3.1.3 主要试剂和药品44-45
• 3.1.4 主要仪器45
• 3.1.5 MAPK阻断剂对番茄花柄外植体LeMAPKs A表达的影响45
• 3.1.6 MAPK阻断剂对离体番茄花柄脱落的影响45-46
• 3.1.7 粗酶液的提取46
• 3.1.8 纤维素酶活力的测定(CMC)46
• 3.1.9 多聚半乳糖醛酸酶活性测定(PG)46
• 3.1.10 果胶酯酶活性测定(PE)46
• 3.1.11 植物激素的提取46
• 3.1.12 数据统计分析46-47
• 3.2 结果与分析47-59
• 3.2.1 番茄花柄脱落率受MAPK阻断剂的影响47
• 3.2.2 MAPK阻断剂对LeMAPKl相对表达的抑制效果47-48
• 3.2.3 MAPK阻断剂对LeMAPK2相对表达的抑制效果48-49
• 3.2.4 MAPK阻断剂对LeMAPK3相对表达的抑制效果49-50
• 3.2.5 MAPK阻断剂对花柄外植体中生长素含量的影响50-51
• 3.2.6 MAPK阻断剂对花柄外植体中脱落酸含量的影响51-53
• 3.2.7 MAPK阻断剂对花柄外植体中赤霉素含量的影响53-54
• 3.2.8 MAPK阻断剂对花柄外植体中纤维素酶活力的影响54-56
• 3.2.9 MAPK阻断剂对花柄外植体中多聚半乳糖醛酸酶活力的影响56-57
• 3.2.10 MAPK阻断剂对花柄外植体中果胶酯酶活力的影响57-59
• 3.3 本章小结59-60
• 第四章 LeMAPKs A参与乙烯诱导的番茄花柄外植体的脱落60-70
• 4.1 材料与方法60-62
• 4.1.1 试验材料60
• 4.1.2 试验处理60-61
• 4.1.3 主要试剂和药品61
• 4.1.4 主要仪器61
• 4.1.5 脱落率的测定61
• 4.1.6 激素水平、细胞壁降解酶活性的测定61-62
• 4.1.7 番茄花柄离区的LeMAPKs A表达的检测62
• 4.1.8 数据统计分析62
• 4.2 结果与分析62-68
• 4.2.1 乙烯和MAPK阻断剂对番茄花柄外植体脱落率的影响62-63
• 4.2.2 MAPK阻断剂对乙烯诱导的番茄外植体脱落中激素水平的影响63-64
• 4.2.3 乙烯和MAPK阻断剂对番茄花柄外植体纤维素酶的影响64-65
• 4.2.4 乙烯和MAPK阻断剂对番茄花柄外植体多聚半乳糖醛酸酶的影响65
• 4.2.5 乙烯和MAPK阻断剂对番茄花柄外植体果胶酯酶的影响65-66
• 4.2.6 乙烯和MAPK阻断剂对番茄花柄外植体LeMAPK1表达的影响66-67
• 4.2.7 乙烯和MAPK阻断剂对番茄花柄外植体LeMAPK2表达的影响67
• 4.2.8 乙烯和MAPK阻断剂对番茄花柄外植体LeMAPK3表达的影响67-68
• 4.3 本章小结68-70
• 第五章 番茄再生系统建立及LeMAPKs A遗传转化研究70-93
• 5.1 材料与方法70-81
• 5.1.1 试验材料70
• 5.1.2 菌株和质粒70
• 5.1.3 主要试剂和药品70-71
• 5.1.4 主要仪器71-72
• 5.1.5 番茄再生系统构建72-73
• 5.1.6 番茄卡那霉素抗性试验73
• 5.1.7 农杆菌感受态的制备73
• 5.1.8 农杆菌的转化73
• 5.1.9 农杆菌单克隆的验证73-74
• 5.1.10 农杆菌侵染番茄,获得再生植株74-75
• 5.1.11 卡那霉素抗性基因PCR引物设计75
• 5.1.12 植株DNA的提取75-76
• 5.1.13 抗性基因的扩增反应体系76
• 5.1.14 植物表达载体构建流程76-77
• 5.1.15 LeMAPKs A全长克隆77-78
• 5.1.16 纯化并回收DNA78
• 5.1.17 目的片段与pEASY-Blunt载体连接78-79
• 5.1.18 大肠杆菌transl-T1的转化79-80
• 5.1.19 大肠杆菌质粒提取80
• 5.1.20 质粒DNA双酶切80-81
• 5.1.21 重组质粒的构建81
• 5.2 结果与分析81-91
• 5.2.1 玉米素对Micro-Tom愈伤组织和不定芽的影响81-82
• 5.2.2 IAA浓度对Micro-Tom番茄愈伤组织产生和不定芽的诱导82-83
• 5.2.3 不同外植体部位对番茄愈伤组织和不定芽诱导的影响83-84
• 5.2.4 不同IBA浓度对不定芽生根的诱导84-85
• 5.2.5 番茄再生过程85-86
• 5.2.6 Kan浓度对番茄子叶不定芽再生的影响86
• 5.2.7 抗性芽的再生86
• 5.2.8 Kan抗性植株的鉴定86-87
• 5.2.9 番茄A类LeMAPKs目的片段的克隆87-88
• 5.2.10 菌落PCR验证88-89
• 5.2.11 番茄的pBI121-LeMAPKs A农杆菌介导转化及植株再生89
• 5.2.12 过表达LeMAPKs A植株鉴定89-90
• 5.2.13 LeMAPKs A过表达番茄表型分析90
• 5.2.14 过表达植株基因LeMAPK1和LeMAPK2相对表达量分析90-91
• 5.3 本章小结91-93
• 全文总结93-99
• 参考文献99-108
• 附录108-109
• 致谢109-110
• 攻读学位论文期间发表文章110

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 李明山;宋秀英;赵晓明;郭失迷;;温光条件和激素配比对番茄叶组织培养的影响[J];山西农业大学学报(自然科学版);1993年04期

  本文关键词：LeMAPKs A类基因在番茄花柄外植体脱落中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：344558