脑心肌炎病毒河南流行株病原学、诊断方法和疫苗的研究
本文关键词:脑心肌炎病毒河南流行株病原学、诊断方法和疫苗的研究,由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】:脑心肌炎(EMC)是由脑心肌炎病毒(EMCV)引起的一种以脑炎、心肌炎和繁殖障碍为主要临诊特征的人畜共患传染病。自然条件下,鼠类是其自然贮存宿主和传播者,感染最广泛和受危害最严重的动物是猪,人感染发病也时有发生。国内于2005年成功分离到首株病毒,现已证实猪群中感染极为普遍,但抗体阳性率差异显著。尽管尚未发生严重疫情,但其威胁日趋严重。河南省地处中原,为养殖大省,加之地理环境复杂,生物多样性丰富,啮齿类动物种类繁多、活动频繁,为EMCV的发生、传播和流行提供了客观条件,但迄今为止,关于本病在河南省的流行病学情况、病原学特征、诊断及防控技术等各项研究均为空白。本文通过对6株不同动物源EMCV河南地方流行株进行分离鉴定、全基因组测序解析、诊断方法建立、致病性试验、基因表达和联合疫苗研究,以期丰富我国EMC的基础理论和临床应用研究,将该病潜在的严重威胁降至最低。1.不同动物源EMCV河南流行株的分离、鉴定及全基因组测序解析为研究EMCV对不同动物的感染情况,本文应用“细胞接种与RT-PCR相结合”方法,成功分离到国内首株地方土猪源、首株家养野猪源、3株良种猪源和1株鼠源EMCV。由此证实EMCV已在河南省猪场中存在;EMCV可引起不同动物感染,提醒在进行地方品种养殖和野生动物家养时要充分考虑人兽共患疫病传播的生态学。6株分离毒的基因组序列全长7 724 bp~7 735 bp不等,彼此间高度同源,与国内猪源、鼠源分离毒处于同一分支。各基因片段中,以VP1和2A变异幅度最大,VP2和3D最为保守。系统进化树显示,EMCV可分为G1、G2和G3 3个群。6株分离毒与国内其他参考毒同属于G1群,但分布并不完全集中,对鼠均具有高致病性。推测鼠是不同猪种之间EMCV交叉感染、传播与流行的重要媒介。不同的EMCV地方流行株间存在较大的地域差异,其传播具有一定的区域限制性。2.EMCV诊断方法的研究建立快速、特异和敏感的检测方法对本病的诊断、流行病学调查、病原学研究及疫苗研发等至关重要。本文以地方土猪源EMCV HNXX13的VP1基因为靶序列,建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,特异性强,重复性良好,灵敏度高,可为EMCV的分子流行病学调查、疫情监测、病原学研究和快速诊断等提供技术平台。对家养野猪源EMCV JZ1202的VP1基因进行原核表达和鉴定,并以该重组蛋白作为包被抗原,建立了检测血清抗体的间接ELISA方法。临床初步应用结果表明,受检的河南省部分猪场阳性场检出率为65.87%,血清总阳性率为45.30%。不同规模和不同阶段猪群均存在EMCV感染,中小型猪场的阳性率显著高于规模化猪场。EMCV与猪圆环病毒2型(PCV-2)的混合感染率高达75.14%。本研究填补了河南省EMCV分子流行病学和血清流行病学监测的空白。3.PCV-2所致免疫抑制条件下继发感染EMCV对仔猪的影响研究了PCV-2所致免疫抑制条件下继发感染EMCV对仔猪生长和致病性的影响。发现PCV-2先期感染可使EMCV对仔猪表现出更为严重的致病性和致死性。仔猪相继感染PCV-2和EMCV后,淋巴细胞比率及EMCV中和抗体较长时间维持在低水平。研究结果表明,EMCV单独感染组后第1 d到第9 d可从猪肛门拭子检测、分离到病毒,而相继感染组的排毒期则可持续至感染后第12 d,提示先感染PCV-2可延长EMCV感染猪的排毒期。4.EMCV/PCV-2二联灭活疫苗的研制和免疫效力测定国外已成功研制出EMC灭活疫苗,与其他疾病的联合疫苗的研究尚未见报道。本文研制出EMCV/PCV-2二联灭活疫苗,接种小鼠和仔猪后发现,免疫效果均高于相应单苗,并可产生各自的高水平抗体,可完全有效抵抗EMCV和PCV-2强毒株的攻击,为2种疾病的联合免疫提供了可能,达到“一针防两病”的效果,满足了EMCV免疫的潜在需求。5.EMCV VP1基因在杆状病毒中的表达及其免疫原性研究应用昆虫杆状病毒表达EMCV国内流行株VP1基因的相关研究极少。本文根据杆状病毒密码子的偏嗜性,对EMCV河南流行毒JZ1201的VP1基因进行优化和人工合成,利用杆状病毒表达系统获得可稳定表达VP1蛋白的重组杆状病毒。免疫小鼠后能产生针对EMCV的高水平特异性中和抗体,且明显高于EMCV全病毒灭活苗,并可明显提高淋巴细胞的分裂、增殖能力,免疫原性良好,为进一步研究其功能以及亚单位疫苗、诊断抗原的研发奠定基础。综上所述,本文为研究我国EMCV的流行病学监测体系、致病机理、快速诊断、免疫机理以及新型疫苗研制等奠定坚实基础,从而为有效防控该病提供科学理论依据。
【关键词】:脑心肌炎病毒 全基因组 诊断 继发感染 真核表达 疫苗
【学位授予单位】:河南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S852.65
【目录】:
- 致谢4-10
- 中文摘要10-12
- Abstract12-15
- 第一章 文献综述15-25
- 1 EMCV概述15-23
- 1.1 病原学15
- 1.2 基因组特征与蛋白构成15-17
- 1.3 流行病学17-18
- 1.4 致病性与公共卫生意义18
- 1.5 致病机制与影响因素18-20
- 1.6 诊断方法20-22
- 1.7 疾病防控22-23
- 2 本文研究目的和意义23-25
- 第二章 不同动物源EMCV河南流行株的分离和鉴定25-32
- 1 引言25
- 2 材料与方法25-27
- 2.1 病料采集25
- 2.2 参考毒株和细胞25
- 2.3 主要试剂和仪器25
- 2.4 病毒分离和纯化25-26
- 2.5 TCID_(50)测定26
- 2.6 病毒理化特性鉴定26
- 2.7 间接免疫荧光试验鉴定26
- 2.8 RT-PCR鉴定26-27
- 3 结果与分析27-30
- 3.1 分离物的获得与命名27-28
- 3.2 病毒形态及理化特性鉴定28-30
- 3.3 间接免疫荧光抗体检测分离物为EMCV阳性30
- 3.4 RT-PCR检测分离物为EMCV阳性30
- 4 结论与讨论30-32
- 第三章 不同动物源EMCV河南流行株的全基因组测序和分析32-47
- 1 引言32
- 2 材料与方法32-34
- 2.1 病毒32
- 2.2 主要试剂、仪器与细胞株32
- 2.3 引物设计32-33
- 2.4 病毒总RNA提取33
- 2.5 全长基因组的RT-PCR扩增和测序33
- 2.6 同源性比较与系统进化分析33-34
- 3 结果与分析34-45
- 3.1 流行株病毒的基因组序列及结构34-35
- 3.2 不同分离株EMCV全基因组及各基因片段的同源性35-37
- 3.3 不同毒株的系统进化关系37-45
- 4 结论与讨论45-47
- 第四章 地方土猪源EMCV SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用47-54
- 1 引言47
- 2 材料与方法47-48
- 2.1 毒株47
- 2.2 主要试剂和仪器47
- 2.3 标准品制备47-48
- 2.4 SYBR Green I real-time PCR方法建立48
- 3 结果与分析48-52
- 3.1 RT-PCR及质粒标准品48
- 3.2 质粒标准品质量浓度48-49
- 3.3 最佳反应条件49
- 3.4 标准曲线49-50
- 3.5 特异性50
- 3.6 敏感性50-51
- 3.7 可重复性51-52
- 3.8 临床初步应用52
- 4 结论与讨论52-54
- 第五章 家养野猪源EMCV VP1基因的原核表达及其间接ELISA方法的建立和应用54-66
- 1 引言54
- 2 材料与方法54-57
- 2.1 病毒、感受态细胞和表达质粒54
- 2.2 血清54
- 2.3 主要试剂与仪器54-55
- 2.4 VP1基因的原核表达55-56
- 2.5 间接ELISA方法最佳反应条件优化56-57
- 2.6 EMC血清流行病学调查57
- 3 结果与分析57-64
- 3.1 获得原核表达抗原57-60
- 3.2 间接ELISA反应条件60-63
- 3.3 EMC血清流行病学63-64
- 4 结论与讨论64-66
- 第六章 PCV-2 所致免疫抑制条件下继发感染EMCV对仔猪的影响66-76
- 1 引言66
- 2 材料与方法66-67
- 2.1 毒株和试验动物66
- 2.2 主要试剂和仪器66
- 2.3 仔猪攻毒试验66-67
- 2.4 组织病理学检测67
- 2.5 淋巴细胞比率测定67
- 2.6 EMCV中和抗体测定67
- 2.7 EMCV排毒情况测定67
- 3 结果与分析67-74
- 3.1 仔猪攻毒试验67-70
- 3.2 体温和日增重变化70-72
- 3.3 组织病理学检测72-73
- 3.4 淋巴细胞比率测定73-74
- 3.5 EMCV中和抗体测定74
- 3.6 EMCV排毒情况测定74
- 4 结论与讨论74-76
- 第七章 EMCV/PCV-2 二联灭活疫苗的研制和免疫效力研究76-87
- 1 引言76
- 2 材料与方法76-80
- 2.1 病毒、细胞和试验动物76
- 2.2 主要试剂和仪器76
- 2.3 病毒液制备76-77
- 2.4 EMCV种毒培养条件研究77
- 2.5 种毒灭活和灭活效果检验77
- 2.6 病毒液浓缩77
- 2.7 灭活疫苗制备77-78
- 2.8 疫苗检验78
- 2.9 小鼠免疫效力检验78-79
- 2.10 仔猪免疫效力检验79-80
- 3 结果与分析80-86
- 3.1 EMCV种毒培养条件80-81
- 3.2 病毒液灭活效果检验81-82
- 3.3 疫苗检验82
- 3.4 小鼠免疫效力检验82-85
- 3.5 仔猪免疫效力检验85-86
- 4 结论与讨论86-87
- 第八章 EMCV VP1基因在杆状病毒中的表达及其免疫原性研究87-96
- 1 引言87
- 2 材料与方法87-89
- 2.1 细胞、质粒、菌种和病毒87
- 2.2 主要试剂87
- 2.3 试验动物87
- 2.4 重组转移质粒p Fast Bac TM1-VP1的构建87
- 2.5 重组穿梭载体Bacmid-VP1构建87-88
- 2.6 重组杆状病毒获得88
- 2.7 SDS-PAGE鉴定88
- 2.8 蛋白纯化和Western blotting分析88
- 2.9 免疫原性研究88-89
- 3 结果与分析89-95
- 3.1 重组转移质粒p Fast Bac TM1-VP1构建89-92
- 3.2 Bacmid-VP1构建及重组杆状病毒获得92
- 3.3 重组蛋白SDS-PAGE鉴定、纯化及Western blotting分析92-94
- 3.4 小鼠免疫试验94-95
- 4 结论与讨论95-96
- 结论96-97
- 参考文献97-108
- 作者简介及博士期间所获科研成果及奖励108-109
- 本研究得到的项目资助109
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,本文编号:345082
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