基于微电极阵列芯片的细胞电融合方法研究

发布时间：2017-05-04 13:03

  本文关键词：基于微电极阵列芯片的细胞电融合方法研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：细胞电融合技术自发明以来,由于其可控性强、操作简便、对细胞无毒害等优点而得到广泛应用,逐渐成为现代生物工程技术中的一个重要工具,被广泛应用于杂交育种、单克隆抗体制备、药物筛选等领域。随着微流控技术和微加工技术的发展,细胞电融合芯片技术在最近十几年发展尤为迅速。细胞电融合芯片技术除了具有传统细胞电融合技术的优点,还更精确高效、集成度高、便于实验观察、样本消耗少,因此在国内外广受关注。本论文运用现代微加工技术制作了基于微电极阵列的细胞电融合芯片,利用介电电泳效应和细胞电穿孔原理实现细胞排队和电融合。细胞排队和电穿孔是电融合中两个最重要的过程,本论文首先对它们的机制和模型进行了深入探讨。在此基础上,运用有限元方法分析了介电电泳效应下细胞的运动状态以及电极结构对细胞跨膜电位分布的影响,并根据仿真结果来优化微电极阵列芯片结构,使电融合过程控制得到优化。基于仿真分析设计了离散式电极和离散式凹槽电极结构模型,并且对芯片加工工艺、材料、封装技术等进行了研究,成功研制了基于薄膜电极、离散式共面电极、离散式凹槽电极结构的细胞电融合芯片。最后,在芯片和融合仪组成的细胞电融合平台上进行了多种细胞的电融合实验,验证了新方法的有效性。具体的说,论文研究的主要工作包括以下几点:①细胞电融合理论分析及仿真研究在细胞介电电泳、细胞电穿孔等相关理论研究基础上,利用有限元分析软件COMSOL Multiphysics#174;对芯片内介电电泳效应下的细胞运动状态进行了分析,为相应的细胞排队控制方法的建立与优化奠定了基础。同时,建立了基于跨膜电位的单细胞穿孔模型,分析了电场分布态势诱导的细胞跨膜电位分布情况,以及该效应下电穿孔区域分布及电穿孔密度分析等;在此基础上,基于电场聚焦效应,分析了离散式共面电极、弧性凹槽电极、矩形凹槽电极结构参数对电场分布态势的影响,探讨了各电极结构下细胞跨膜电位分布情况,并从中选取定型了较优的凹槽微电极阵列,研制了对应的微流控芯片,从而优化了电穿孔/电融合过程控制,可以有效避免多细胞融合以及改善融合率等。②细胞电融合微流控芯片的优化在理论分析和仿真计算基础上,从芯片结构、材料、加工工艺、封装等方面对细胞电融合芯片进行优化设计,研制了三种芯片:基于薄膜电极、基于离散式共面电极、基于离散式凹槽电极的细胞电融合芯片。在材料选择上主要采用低阻硅、金、铝作为电极材料,采用聚酰亚胺多聚物、“Si O2-多晶硅-Si O2绝缘槽”+“浮地硅”结构填充两相邻凸齿状微电极之间的凹陷区;选择了石英玻璃、SOI等材料作为芯片基底;同时选择了软光刻、IC工艺等制造工艺。这一系列芯片在实验中表现出良好的生物相容性、抗化学腐蚀性及电气性能等。③基于微流控芯片的细胞电融合系统平台的建立根据实验要求,利用细胞电融合芯片和细胞电融合仪,搭建了基于微阵列电极芯片的细胞电融合系统平台。该实验平台具有操作简便、可控性好、实验效果好等特点。通过显微镜和CCD构成的图像观察和采集系统,可以清晰观察并记录细胞电融合的全过程,并且实验中可根据融合情况随时调整融合参数,获得理想的排队效率及融合效率。④微流控芯片上细胞电融合验证实验研究及分析利用基于微流控芯片的细胞电融合系统平台研究了多种细胞的排队、融合实验条件和参数,包括K562细胞、NIH3T3细胞、成肌细胞等。新研制的芯片解决了细胞吸附在凹陷区无法融合这一问题。此外,这些新设计的微电极也使电场更加集中,降低了排队电压和融合电压。通过反复实验探索获得了细胞排队及融合所需的电参数,并且得到了较高的细胞排队率与细胞融合率。相对于PEG方法和传统电融合法,新设计的微电极芯片的排队及融合效率有了显著提高,其中在薄膜电极芯片上K562细胞两两排队效率为70.7%,融合率达到大约43.1%的水平;在离散式共面电极芯片上,几乎100%的NIH3T3细胞排列在电极上,两两排队效率达到69.8%,融合效率达到40%;在离散式凹槽电极芯片上,98%的NIH3T3细胞进入凹槽,大约67.9%凹槽内的细胞两两排队,融合效率达到了50.3%。总之,通过对细胞电融合芯片的优化设计,本论文研制出高排队效率、高融合率的细胞电融合芯片,建立了集成融合芯片及电融合仪的细胞电融合微系统实验平台。在对多种细胞的电融合实验中,取得了较好的实验效果。该研究为建立高效、自动的细胞融合芯片系统奠定了基础,有望进一步应用于实际研究,如杂交育种、体细胞再程序化等。
【关键词】：细胞融合 电穿孔 微流控 介电电泳 跨膜电位
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q813.2
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-10
• 1 引言10-26
• 1.1 研究背景及意义10-13
• 1.2 微流控芯片上细胞电融合研究现状13-22
• 1.2.1 细胞排队（配对）13-21
• 1.2.2 细胞可逆电穿孔21-22
• 1.3 现有方法中存在的问题22-24
• 1.4 本论文研究的内容及目标24-25
• 1.5 本论文工作的意义25-26
• 2 理论分析及仿真研究26-48
• 2.1 细胞排队的机制与模型26-35
• 2.1.1 介质的极化现象及受力分析26-29
• 2.1.2 介电电泳中的细胞模型29-31
• 2.1.3 细胞在DEP作用下的运动仿真31-35
• 2.2 细胞膜电穿孔的机制与模型35-45
• 2.2.1 细胞电穿孔理论基础35-39
• 2.2.2 单细胞穿孔模型39-45
• 2.3 细胞电融合的机制与模型45
• 2.4 本章小结45-48
• 3 基于薄膜电极的细胞电融合芯片研究48-60
• 3.1 芯片的设计48-50
• 3.1.1 芯片的设计思想48-49
• 3.1.2 芯片的结构设计49-50
• 3.2 芯片仿真50-51
• 3.3 芯片的加工及封装实现51-54
• 3.4 实验平台的建立54-55
• 3.5 细胞电融合实验研究55-58
• 3.5.1 实验材料55
• 3.5.2 排队实验研究55-56
• 3.5.3 细胞电融合实验结果56-58
• 3.6 本章小结58-60
• 4 基于离散式共面电极的细胞电融合芯片研究60-70
• 4.1 芯片的设计思想60-61
• 4.2 芯片的加工及封装61-64
• 4.2.1 芯片的加工工艺61-63
• 4.2.2 芯片的封装63-64
• 4.2.3 芯片测试64
• 4.3 实验平台的建立64-65
• 4.4 细胞电融合实验研究65-68
• 4.4.1 实验对象65-66
• 4.4.2 排队实验研究66
• 4.4.3 细胞电融合实验结果66-68
• 4.5 本章小结68-70
• 5 基于离散式凹槽电极的细胞电融合芯片70-94
• 5.1 芯片的设计思想70-84
• 5.1.1 基于弧形凹槽微电极阵列结构的电场及跨膜电位仿真研究72-75
• 5.1.2 基于矩形凹槽微电极阵列结构的电场及跨膜电位仿真研究75-84
• 5.2 芯片的加工及封装实现84-87
• 5.3 实验平台的建立87
• 5.4 细胞电融合实验研究87-91
• 5.4.1 实验对象87-88
• 5.4.2 排队实验研究88-90
• 5.4.3 细胞电融合实验结果90-91
• 5.5 本章小结91-94
• 6 总结及展望94-100
• 6.1 所取得的研究结果94-95
• 6.2 研究目标的实现95-96
• 6.3 创新点96
• 6.4 存在的不足与展望96-100
• 致谢100-102
• 参考文献102-110
• 附录110-111
• A. 作者在攻读学位期间发表的论文目录110
• B. 作者在攻读学位期间取得的科研成果目录110-111
• C. 作者在攻读学位期间参与的科研项目111

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本文编号：345098