昆虫几个蜕皮相关酶的表达和功能分析

发布时间：2017-05-04 14:15

  本文关键词：昆虫几个蜕皮相关酶的表达和功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：蜕皮是线虫和节肢动物等蜕皮类动物特有的生命现象,是昆虫发育变态的重要程序之一,也是昆虫个体生长所必需的生命过程。蜕皮包括真皮细胞活动加强、表皮分离、蜕皮液分泌、新表皮形成、旧表皮蜕去等一系列连续的过程。在这些过程中,与其相关的酶表达也在发生着重大的变化。本研究通过对家蚕和牧草盲蝽几种蜕皮相关酶的表达量分析,明确了蜕皮激素与蜕皮过程中的酶类尤其是酚氧化酶,多巴脱羧酶及几丁质酶密切相关。主要研究结果如下：(1)克隆并鉴定了家蚕酚氧化酶原基因(BmPPO)。家蚕酚氧化酶原基因由PPO1和PPO2两种同工酶构成。家蚕酚氧化酶原Ⅰ(BmPPOI)ORF全长2058 bp,编码685个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为79 kDa,等电点为6.25。家蚕酚氧化酶原ⅠI(BmPPO2)的ORF全长2082bp,编码693个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为80kDa,等电点为5.6。通过定量分析酚氧化酶在小蚕期和大蚕期各组织的转录表达量,表明酚氧化酶在小蚕期的表达趋势与家蚕蜕皮过程吻合,即蜕皮时表达量较高,而后下降。酚氧化酶在大蚕期各组织中的表达差别较大,在血淋巴和头部表达量较高,在表皮和生殖器官中表达量较低。人工添食蜕皮激素确定血淋巴中蜕皮激素含量明显升高的情况下,家蚕体内酚氧化酶表达量明显地升高,说明酚氧化酶是蜕皮过程中非常关键的酶类并且其表达受蜕皮激素的影响。PPo1 RNA干扰后家蚕幼虫酚氧化酶基因表达量明显下降,蛹期表型出现少数的不完全化蛹现象。但RNA干扰后的表型效果不明显,可能是由于家蚕体内酚氧化酶不是单一的一种酶,而是一组酶。当干扰一种酚氧化酶,其干扰效果被其他的酚氧化酶弥补。RNA干扰后不同组织的酚氧化酶活性变化趋势不同,头部和血淋巴中酚氧化酶活性显著高于对照,但在表皮中RNA干扰导致了酚氧化活性的下降,说明RNA干扰对不同组织的作用效果不同,可能在不同组织间具有协调作用。(2)克隆并鉴定了家蚕多巴脱羧酶(BmDdc)基因。多巴脱羧酶ORF全长1437 bp,编码478个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为54 kDa,等电点为5.8。通过Real-TimePCR荧光定量对多巴脱羧酶在小蚕期和大蚕期各组织的表达量分析,表明多巴脱羧酶在2龄前的表达量较低,在2龄眠蚕表达量大幅上升,而后下降；小蚕后期表现有规律的表达趋势,基本上是在眠蚕时期表达量高。BmDdc在大蚕期(5龄)的表皮、头部和生殖腺的表达量变化比较大,在熟蚕和蛹前有相对较高的表达量。人工添食蜕皮激素确定血淋巴中蜕皮激素含量明显升高的情况下,家蚕体内多巴脱羧酶表达量与对照相比明显升高,说明多巴脱羧酶表达受蜕皮激素的影响,是蜕皮过程中关键性的酶类。BmDdc RNA干扰家蚕幼虫24hr表达量明显的下降,蛹期表型出现34.4%不完全化蛹或者不化蛹表型,干扰效果明显。用液相色谱检测RNA干扰后不同组织的多巴脱羧酶活性,发现不同组织变化趋势不大。原核表达多巴脱羧酶并制作抗体,大小符合理论值。多抗检测其在近细胞膜的细胞质内合成表达,而后通过内质网、高尔基体运输到细胞外参与体表的硬化和鞣化。推测多巴脱羧酶在未蜕皮前在细胞内大量合成,蜕皮后释放到细胞外发挥作用。组织免疫荧光检测表明,其主要在头部的表面和神经器官及表皮的真皮层表达,这与其作用相一致。(3)测定了牧草盲椿的蜕皮激素滴度,其在雌雄昆虫表现高度的一致性,即5龄的中后期升高,变态完成后降低,这与蜕皮激素的作用一致。我们克隆了可能与蜕皮激素相关的几种酶的ORF,并对其进行不同时期和组织的表达量分析。结果表明,只有牧草盲椿几丁质酶基因表现出明显的规律性和一致性,且表达规律与蜕皮过程相协调。蜕皮激素的早期诱导(刚孵化的5龄若虫)明显提高了昆虫的死亡率,尤其是在若虫期,同时也明显降低了其变态率,并导致几丁质酶基因表达推迟。蜕皮激素晚期诱导(5龄第6天,16.9℃条件下5龄持续约12天)同样会增加昆虫的死亡率,但是在成虫期表现更为明显,且变态效率显著降低。同时蜕皮激素延长单个昆虫的蜕皮过程,对蜕皮的阻滞作用强于早期诱导,最终导致20%以上的昆虫在变态过程中死亡,这表明高浓度的蜕皮激素阻滞而非像其他昆虫那样促进盲椿的变态发育。对于蜕皮机制的研究可帮助我们了解昆虫的生命规律,同时利用其生命阶段的某些特征来对相关农业害虫进行防治或者对益虫充分地利用。蜕皮激素对于蜕皮过程的综合调控可应用于实际的生产中：如家蚕5龄末期使用蜕皮激素,能使家蚕龄期缩短,促进老熟变态,吐丝营茧速度相对加快,这可作为缺桑叶时一种提早上蔟的应急措施,并提高上蔟整齐度。牧草盲椿蜕皮激素对其变态过程的阻滞作用可用于害虫控制。因此阐明昆虫蜕皮相关基因表达和调控,将为害虫防治和益虫生长发育调控提供新的思路。
【关键词】：家蚕 牧草盲椿 蜕皮激素 酚氧化酶 多巴脱羧酶 几丁质酶 RNAi
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q966
【目录】：

• 中文摘要9-11
• Abstract11-14
• 主要英文缩写与译名14-15
• 第一章 文献综述15-23
• 1.1 家蚕及盲椿简介15-17
• 1.2 蜕皮激素在昆虫生长发育及蜕皮过程中的作用17
• 1.3 昆虫蜕皮过程中血液或表皮主要酶系的变化17-18
• 1.4 蜕皮相关酶的概述18-20
• 1.5 实验相关技术概述20-23
• 1.5.1 RNA干扰技术20-21
• 1.5.1.1 RNA干扰的作用机制20
• 1.5.1.2 RNA干扰的实现方法-体外酶法20-21
• 1.5.2 荧光定量PCR技术21
• 1.5.3 免疫荧光技术21-23
• 第二章 研究内容及结果23-113
• 第一节 家蚕部分23-81
• 1 家蚕蜕皮相关酶的生物信息学分析23-38
• 1.1 酚氧化酶的生物信息学分析23-29
• 1.1.1 酚氧化酶原Ⅰ(PPO1)的生物信息学分析23-26
• 1.1.2 酚氧化酶原Ⅱ(PPO2)的生物信息学分析26-29
• 1.2 几丁质酶(Chi)的生物信息学分析29-31
• 1.3 多巴脱羧酶(BmDdc)的生物信息学分析31-34
• 1.4 酪氨酸羟化酶(Th)的生物信息学分析34-37
• 1.5 乙酰转移酶(At)的生物信息学分析37-38
• 2 家蚕蜕皮相关酶基因的表达量分析38-49
• 2.1 蜕皮相关酶基因小蚕期的表达量分析38-44
• 2.1.1 材料与试剂38-39
• 2.1.2 方法39-41
• 2.1.2.1 家蚕幼虫前期全蚕总RNA的提取及第一链cDNA合成39-41
• 2.1.2.2 蜕皮相关酶基因在家蚕幼虫前期的荧光定量PCR分析41
• 2.1.3 结果与讨论41-44
• 2.2 蜕皮相关酶基因在大蚕期各组织的表达量分析44-49
• 2.2.1 材料与试剂44-45
• 2.2.2 方法45
• 2.2.2.1 家蚕各组织总RNA的提取及第一链cDNA合成45
• 2.2.2.2 蜕皮相关酶基因在大蚕期各组织的定性分析45
• 2.2.2.3 蜕皮相关酶基因在大蚕期各组织的定量分析45
• 2.2.3 结果和分析45-49
• 2.2.3.1 蜕皮相关酶基因在大蚕期各组织的定性分析45-46
• 2.2.3.2 蜕皮相关酶基因在大蚕期各组织的定量分析46-49
• 3 蜕皮激素对酶表达的影响49-55
• 3.1 材料与试剂49
• 3.2 方法49-51
• 3.2.1 家蚕各组织总RNA的提取及第一链cDNA合成49-50
• 3.2.2 蜕皮激素的添食50
• 3.2.3 蜕皮激素滴度的测定50-51
• 3.3 结果及分析51-55
• 3.3.1 添食蜕皮激素对家蚕蜕皮激素滴度的影响51
• 3.3.2 添食蜕皮激素对蜕皮相关基因表达量的影响51-55
• 4 家蚕蜕皮激素相关酶基因的RNAi研究55-66
• 4.1 家蚕酚氧化酶基因的RNAi研究55-61
• 4.1.1 材料与试剂55
• 4.1.2 方法55-58
• 4.1.2.1 RNA的提取和cDNA的合成55
• 4.1.2.2 dsRNA的合成55-58
• 4.1.2.3 RNAi试验58
• 4.1.2.4 酚氧化酶活性的测定58
• 4.1.3 结果及分析58-61
• 4.1.3.1 家蚕酚氧化酶RNAi对表型的影响58-60
• 4.1.3.2 家蚕酚氧化酶RNAi对酶活性的影响60-61
• 4.1.3.3 家蚕酚氧化酶RNAi对酶基因表达量的影响61
• 4.2 家蚕多巴脱羧酶的RNAi研究61-66
• 4.2.1 材料与试剂61
• 4.2.2 方法61-62
• 4.2.2.1 RNA的提取和cDNA的合成61-62
• 4.2.2.2 dsRNA的合成62
• 4.2.2.3 RNAi试验62
• 4.2.2.4 多巴脱羧酶活性测定62
• 4.2.3 结果与分析62-66
• 4.2.3.1 家蚕多巴脱羧酶RNAi对表型的影响62-64
• 4.2.3.2 家蚕多巴脱羧酶RNAi对酶活性的影响64-65
• 4.2.3.3 家蚕多巴脱羧酶RNAi对基因表达的影响65
• 4.2.3.4 细胞多巴脱羧酶RNAi对蜕皮相关基因表达量的影响65-66
• 5 家蚕多巴脱羧酶(BmDdc)的表达及定位66-81
• 5.1 材料与试剂66-69
• 5.2 方法69-74
• 5.2.1 BmDdc基因表达载体的构建69
• 5.2.2 BmDdc基因在大肠杆菌中的表达69
• 5.2.3 Western Blot69-70
• 5.2.4 BmDdc融合表达产物的纯化70
• 5.2.5 多克隆抗体的制备及纯化70-71
• 5.2.6 多克隆抗体的组织鉴定71-73
• 5.2.6.1 家蚕BmN细胞及组织的蛋白提取71
• 5.2.6.2 BmDdc抗体的组织检测71-73
• 5.2.7 BmDdc的细胞定位73
• 5.2.7.1 细胞的dsRNA处理73
• 5.2.7.2 细胞免疫荧光分析73
• 5.2.8 BmDdc的组织定位73-74
• 5.3 结果与讨论74-81
• 5.3.1 BmDdc的原核表达74-76
• 5.3.2 BmDdc多克隆抗体的组织鉴定76
• 5.3.3 BmDdc的细胞与组织定位76-81
• 第二节 牧草盲椿部分81-113
• 1 牧草盲椿的生命发育规律81-84
• 1.1 实验方法82
• 1.2 牧草盲蝽生命发育过程82-84
• 2 牧草盲蝽蜕皮相关酶基因的克隆84-88
• 2.1 实验方法84-88
• 2.1.1 模板的合成84-85
• 2.1.2 蜕皮相关酶基因的克隆85-86
• 2.1.3 序列测序86-88
• 2.1.3.1 PCR产物连接86
• 2.1.3.2 连接产物转化86
• 2.1.3.3 克隆产物的检测86-88
• 2.2 结果分析88
• 3 牧草盲椿蜕皮相关酶基因的表达谱88-99
• 3.1 半定量分析88-93
• 3.1.1 实验方法88-90
• 3.1.2 实验结果90-93
• 3.1.2.1 组织表达量分析90-91
• 3.1.2.2 发育时期表达量分析91
• 3.1.2.3 组织时期表达分析91-93
• 3.2 定量分析93-99
• 3.2.1 试验方法93-95
• 3.2.2 实验结果95-99
• 4 几丁质酶基因的生物信息学分析99-104
• 5 牧草盲椿蜕皮激素浓度的测定104-108
• 5.1 试验方法104-106
• 5.1.1 实验样品的收集104
• 5.1.2 蜕皮激素浓度的测定104-106
• 5.2 实验结果106-108
• 6 牧草盲椿蜕皮激素调控108-113
• 6.1 实验材料与方法108-109
• 6.1.1 蜕皮激素调控的早期诱导108
• 6.1.2 牧草盲椿蜕皮激素的晚期诱导108-109
• 6.2 实验结果109-113
• 6.2.1 早期诱导的基因表达109
• 6.2.2 早期诱导对生长发育的影响109-110
• 6.2.3 蜕皮激素晚期诱导对生长发育的影响110-113
• 第三章 结论及后续研究展望113-117
• 3.1 主要结论113-114
• 3.2 创新点114
• 3.3 后续研究展望114-117
• 参考文献117-124
• 附录124-127
• 攻读博士学位期间发表论文124-126
• 参与课题126-127
• 致谢127

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 马晓春;韩宏岩;许维岸;;家蚕表皮多酚氧化酶的分离纯化及酶学性质研究[J];安徽农业科学;2009年17期

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本文编号：345233