Hnrnpk及Dnmts在哺乳动物雄性生殖细胞发育过程中的表达及功能研究

发布时间：2017-05-05 08:09

  本文关键词：Hnrnpk及Dnmts在哺乳动物雄性生殖细胞发育过程中的表达及功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：哺乳动物雄性生殖细胞发育是一个复杂的生物学过程。这一过程受到体内外多层次的精确调控,其中精子发生过程相关基因的正确表达对整个生精过程起着至关重要的作用。对这些基因在哺乳动物雄性生殖细胞发育过程中的表达及相关功能的研究,将有助于我们深入阐明精子发生的分子调控机理,从而有针对性地为解决家畜繁殖障碍及雄性不育问题提供新的思路。异质性胞核核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,Hnrnpk)作为一个多功能蛋白,广泛参与了染色体包装、转录调控、选择性剪接和翻译等过程,有着重要的生物学功能,与生殖细胞发育和精子发生关系密切。而精子发生过程伴随着生殖细胞基因组DNA甲基化的重建,由DNA甲基化酶(DNA methyltransferases,Dnmts)介导的DNA甲基化异常会影响生殖细胞发育和精子发生。本研究选择生殖细胞发育相关基因Hnrnpk和Dnmts作为研究的切入点,从克隆猪Hnrnpk基因着手,进一步对其分子结构特征、表达定位模式、生物学功能展开系统研究并对其相关作用机理进行了初步探索;同时建立了不同发育时期大鼠Dnmts的动态表达谱,并对其调控因素进一步探寻;这些研究结果将为揭示其在精子发生过程中的重要作用奠定基础。取得的主要研究结果如下:(1)克隆得到猪的Hnrnpk基因,其c DNA全长为2712 bp,包含1392 bp的开放阅读框,编码463个氨基酸,起始密码子位于230-232 bp处,终止密码子位于1622-1624 bp处,5’端非翻译区共229 bp,3’端非翻译区共1091 bp。根据序列比对及基因结构分析,推测出猪的Hnrnpk基因全长约为12.3 kb,包含17个外显子和16个内含子,该基因的外显子与内含子相连碱基符合GT/AG法则。通过RACE和进一步的PCR扩增发现猪上至少存在8种不同的转录本,主要是由于外显子1、8及17的选择性剪接引起,且8种不同的转录本对应4种蛋白。(2)Hnrnpk在猪睾丸、骨骼肌及脂肪等组织中相对高表达,肺、肾、卵巢及大脑等组织中次之,心和肝组织中表达相对较低;而在猪睾丸组织发育早期Hnrnpk表达量较高,这一结果在不同发育时期大鼠睾丸组织也得到进一步验证。定位分布结果表明三个不同发育时期猪睾丸组织曲细精管中Hnrnpk主要定位于精原细胞、精母细胞胞核与精子细胞胞浆,在支持细胞和肌样细胞也有分布。提示Hnrnpk可能在生殖细胞发育过程中发挥重要作用。(3)设计并合成3对si RNA,转染C18-4及GC-1spg细胞,筛选得到si RNA-1100干扰效率在80%以上。与si RNA-NC及Mock转染组相比较,si RNA-Hnrnpk转染组细胞数量明显减少,离散分布在视野中,且有较多漂浮细胞。通过细胞计数及Cell Titer-Glo?细胞增殖检测发现转染48 h细胞数量显著低于对照组(P0.05),而凋亡检测显示TUNEL阳性细胞数显著高于对照组(P0.05);结果表明Hnrnpk的敲低减少了细胞数量,促进了细胞凋亡。(4)转录组测序分析发现敲低的GC-1spg差异表达的基因中24个基因与细胞增殖有关,15个基因参与调控细胞凋亡。Icmt、Oaz1、Nanog、Fntb等正向调控增殖基因表达下调,Nos2、Ptpn6、Serpine1、Spry1等负调控增殖的基因则表达上调。此外,Xiap、Rap1GAP1、Sirt1等抗凋亡基因表达下调,Caspase2、Caspase3等促凋亡基因则表达上调。这些结果表明Hnrnpk可能通过调控上述增殖凋亡相关基因的表达来发挥其生物学功能。(5)不同发育时期大鼠Dnmts的动态表达谱表明:在大鼠胚胎期睾丸组织中Dnmt3a表达量较高,其中在18.5胚龄达到最高水平,出生后逐渐降低,Dnmt3l的表达模式与Dnmt3a较为相似。而Dnmt3b出生前表达量较低,出生后逐渐升高。与Dnmt3相比,不同发育时期Dnmt1表达量相对较低,其表达趋势与Dnmt3b相似。结果提示大鼠睾丸组织发育过程中,Dnmt3a与Dnmt3l可能相互协调在DNA甲基化重建过程发挥作用,而Dnmt3b与Dnmt1可能作用于DNA甲基化维持。(6)出生后不同发育时期大鼠mi R29的动态表达谱与Dnmt3a和Dnmt3b相反,mi R29 inhibitor转染实验证实mi R29能够负调控Dnmt3a和Dnmt3b。结果提示mi R29可能通过介导Dnmts在出生后大鼠睾丸组织发育过程中发挥重要作用。综上所述,Hnrnpk在雄性生殖细胞发育过程中表达,并通过调控增殖与凋亡相关基因的表达决定细胞的命运。在大鼠睾丸组织发育过程中Dnmts呈现动态表达模式,Dnmt3a和Dnmt3l可能相互作用协调建立DNA甲基化模式,而Dnmt3b和Dnmt1可能参与DNA甲基化维持。同时,在这个过程中mi R29可能通过负调控Dnmts的表达而发挥作用。
【关键词】：雄性生殖细胞 Dnmts Hnrnpk 表达 功能研究
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q954.4
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 文献综述14-36
• 1.1 哺乳动物雄性生殖生物学研究概况14-20
• 1.1.1 睾丸组织结构及功能14-15
• 1.1.2 精子发生与生精上皮周期15-16
• 1.1.3 雄性生殖细胞发育16-17
• 1.1.4 精原干细胞17-20
• 1.2 Hnrnpk基因结构及功能研究概况20-31
• 1.2.1 Hnrnpk蛋白结构21-22
• 1.2.2 Hnrnpk的表达及调控22-23
• 1.2.3 Hnrnpk的翻译后修饰23-24
• 1.2.4 Hnrnpk的生物学功能24-29
• 1.2.5 Hnrnpk与生殖发育29-31
• 1.2.6 展望31
• 1.3 精子发生过程中DNA甲基化的研究概况31-34
• 1.3.1 精子发生过程中DNA甲基化酶的研究概况33
• 1.3.2 精子发生过程中DNA甲基化酶调控的研究概况33-34
• 1.4 研究的目的与意义34-36
• 第二章 Hnrnpk基因的克隆及表达研究36-63
• 2.1 前言36
• 2.2 材料与方法36-48
• 2.2.1 实验材料36-37
• 2.2.2 主要实验仪器37-38
• 2.2.3 主要化学药品及试剂38
• 2.2.4 主要溶液配方38-40
• 2.2.5 猪Hnrnpk基因的克隆40-42
• 2.2.6 实时荧光定量PCR42-43
• 2.2.7 Western blotting分析43-45
• 2.2.8 免疫组织荧光分析45-46
• 2.2.9 载体构建46-47
• 2.2.10 细胞培养47-48
• 2.2.11 质粒转染48
• 2.3 结果与分析48-60
• 2.3.1 总RNA的提取和检测结果48-49
• 2.3.2 猪Hnrnpk基因的克隆和序列分析49-54
• 2.3.3 猪Hnrnpk基因及其缺失体的亚细胞定位54-55
• 2.3.4 猪Hnrnpk基因的时空表达分析55-56
• 2.3.5 Hnrnpk在不同发育阶段猪睾丸组织中的表达及定位56-57
• 2.3.6 Hnrnpk在不同发育阶段大鼠睾丸组织中的表达及定位57-60
• 2.4 讨论60-63
• 第三章 Hnrnpk基因对小鼠精原细胞增殖与生存的调节作用63-85
• 3.1 前言63
• 3.2 材料与方法63-70
• 3.2.1 材料63-64
• 3.2.2 主要方法64-66
• 3.2.3 转录组测序66-70
• 3.3 结果与分析70-79
• 3.3.1 Hnrnpk在GC-1spg和C18-4 中的表达70
• 3.3.2 siRNA- Hnrnpk干扰效率检测70
• 3.3.3 siRNA-Hnrnpk干扰后对GC-1spg细胞表型的影响70-72
• 3.3.4 siRNA- Hnrnpk干扰后对GC-1spg细胞增殖影响72-73
• 3.3.5 siRNA- Hnrnpk干扰后对GC-1spg细胞凋亡的影响73
• 3.3.6 siRNA- Hnrnpk干扰后细胞增殖分化凋亡相关基因检测73-74
• 3.3.7 转录组测序74-79
• 3.4 讨论79-85
• 第四章 雄性大鼠睾丸发育过程中Dnmts的表达研究85-95
• 4.1 前言85
• 4.2 材料与方法85-88
• 4.2.1 实验材料85
• 4.2.2 主要溶液配方85-86
• 4.2.3 miRNA29 inhibitor及探针合成86
• 4.2.4 主要方法86-88
• 4.3 结果与分析88-93
• 4.3.1 Dnmts在大鼠不同发育时期睾丸组织中mRNA水平的表达88-89
• 4.3.2 Dnmts在大鼠不同发育时期睾丸组织中蛋白水平的表达89
• 4.3.3 免疫组化检测Dnmts在不同发育时期大鼠睾丸组织中的表达89-91
• 4.3.4 miR29 在不同发育时期大鼠睾丸组织中的表达91-92
• 4.3.5 miRNA29 inhibitor转染GC-1spg细胞92-93
• 4.4 讨论93-95
• 结论95-96
• 创新点96-97
• 下一步研究工作97-98
• 参考文献98-114
• 附录114-130
• 致谢130-131
• 作者简介131

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本文编号：345981