AMPK-α在卤虫胚胎发育过程中对细胞有丝分裂调控的研究

发布时间：2017-05-07 18:08

  本文关键词：AMPK-α在卤虫胚胎发育过程中对细胞有丝分裂调控的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：卤虫,又名丰年虫,是一种具有4亿年进化历史的甲壳类动物。卤虫主要生存于内陆盐湖、海滨盐田等高盐水域。卤虫在这样极端的环境中进化出了两种不同的生殖方式：卵胎生和卵生。在水温适宜,日照较长,水域盐度适中的季节里,卤虫以卵胎生方式繁殖,即胚胎直接发育成能够游动的无节幼体。当水温下降,日照变短,生存水域盐度升高时,卤虫以卵生方式繁殖,胚胎在母体内发育一定阶段后,以外面包有卵壳的休眠胚胎形式被排出母体外。在休眠胚胎细胞内,细胞周期处于静止状态。休眠胚胎只有经过低温刺激,才能转变成活化的休眠胚胎。当适宜的环境来临时,活化的休眠胚胎继续发育,细胞周期也重新开始。卤虫胚胎所具有的这种能够使细胞周期发生停滞和重新开始的特性,使得卤虫成为了研究细胞有丝分裂的良好模式动物。研究指出AMPK是生命能量调控的中心。AMPK-α亚基是催化亚基,因此α亚基对于AMPK激酶功能的发挥起着重要的作用。在大多数物种中,AMPK-α亚基有两个异构体,即AMPK-α1和-α2。研究表明,AMPK-α1和-α2除了调控生命的能量状态之外,两个亚基在不同的组织,生长发育的不同阶段发挥着各自特有的调控功能。然而,AMPK-α1和-α2对于细胞有丝分裂的调控仍然不清楚。首先,我们检测了卵胎生卤虫胚胎发育过程中AMPK-α和-α2及其磷酸化的表达特征。Western blotting结果表明,在胚胎整个发育过程中,AMPK-α1的表达及其磷酸化维持在一个较为恒定的水平上。然而,AMPK-α2蛋白只在胚胎发育早期和无节幼体阶段有极微量的表达。因此我们推测AMPK-α1可能参与调控了胚胎发育过程中的有丝分裂。AICAR (AMPK的激活剂)注射和BrdU参入实验指出,注射了AICAR的卤虫胚胎细胞内部检测不出BrdU阳性信号。这个结果表明高活性的AMPK能够抑制细胞周期的进行和细胞的有丝分裂。此外,我们检测了卤虫休眠胚胎重新发育过程中AMPK-α1和-α2及其磷酸化的表达情况。从休眠胚胎重新发育的4小时到8小时,AMPK-α1的表达水平下降。从重新发育的12小时到24小时,AMPK-α1的表达水平上升。AMPK-α2随着发育的进行表达量一直升高。AMPK-α的磷酸化水平在休眠胚胎重新发育的前12小时保持在一个较高的水平,而在孵化出的无节幼体阶段降低到了胚胎发育第4小时的三分之一。BrdU参入实验表明,在重新发育的12小时之前,卤虫细胞内没有有丝分裂的发生。从发育的12小时之后,卤虫细胞内有大量的有丝分裂发生。免疫沉淀实验表明,细胞未发生有丝分裂时AMPK保持高磷酸化状态,而在有丝分裂时AMPK磷酸化水平降低。这些结果再次表明,高活性的AMPK能够抑制细胞的有丝分裂。为了研究AMPK的上游激酶LKB1对AMPK调控卤虫胚胎发育过程中细胞有丝分裂的影响,我们克隆了卤虫LKB1基因。卤虫lkbl编码373个氨基酸,分子进化分析结果表明卤虫与水蚤LKB1的亲缘关系最近。荧光定量PCR显示,在卤虫胚胎发育期间,双线期和无节幼体阶段lkb1的表达量与双卵期、胚胎发育早期和胚胎发育晚期有显著性差异。在休眠胚胎重新发育阶段,重启发育的第4小时和第8小时lkb1的表达量与以后的发育阶段的表达量有显著性差异。利用siRNA干扰技术,我们分别在卵胎生和卵生生殖方式的卤虫体内注射siRNA分子,降低lkb1的表达量。对早期胚胎形态的观察结果表明,lkb1的降低没有影响胚胎的早期发育。我们继续对发育中的胚胎进行观察,发现卵胎生的卤虫能产下正常游动的无节幼体。然而,卵生卤虫却产下发育不良的假胚胎。这些结果表明,LKB1只特异性的调控卵生卤虫的胚胎发育。最后,我们检测了卵生卤虫胚胎发育早期的细胞有丝分裂和AMPK的磷酸化状况。Western Blotting结果表明,lkbl表达量的降低能够促进细胞的有丝分裂。同时,降低lkbl的表达量之后,AMPK-α1的磷酸化水平下降。这些结果指出,LKB1-AMPK-α1对卤虫胚胎发育过程中的有丝分裂起着调控作用。同时,TUNEL实验结果表明,卤虫假胚胎形成的原因是lkbl表达量的降低导致了发育早期的细胞发生了凋亡我们的实验结果表明,AMPK参与调控了卤虫胚胎发育过程中细胞的有丝分裂过程。高活性的AMPK抑制细胞的有丝分裂,而且这种调控作用是通过AMPK的上游激酶LKB1来实现的。
【关键词】：卤虫 胚胎发育 休眠胚胎 胚胎发育重启 AMPK-α1 AMPK-α2 AMPK磷酸化 有丝分裂 免疫沉淀 DSS交联 LKB1
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q344
【目录】：

• 致谢6-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-20
• 缩略词和术语表20-21
• 第一章 绪论21-37
• 1.1 研究背景21-36
• 1.1.1 卤虫概述21-24
• 1.1.2 AMPK的研究概述24-27
• 1.1.2.1 AMPK总述24
• 1.1.2.2 AMPK的结构24-26
• 1.1.2.3 AMPK的调节26-27
• 1.1.3 LKB1的研究概述27-30
• 1.1.3.1 LKB1总述27-28
• 1.1.3.2 LKB1的结构以及后修饰28-29
• 1.1.3.3 LKB1、STRAD和M02529-30
• 1.1.4 LKB1—AMPK信号通路30-36
• 1.1.4.1 LKB1—AMPK—mTORC1信号通路30-31
• 1.1.4.2 LKB1—AMPK—p53信号通路31-32
• 1.1.4.3 LKB1—AMPK信号通路对于细胞极性的调节32-33
• 1.1.4.4 LKB1—AMPK信号通路对于细胞代谢的调控33-36
• 1.2 展望36
• 1.3 研究目的、方法和意义36-37
• 第二章 AMPK-α1和-α2在卵胎生卤虫胚胎发育过程中的表达及活性分析37-56
• 摘要37
• 2.1 引言37-38
• 2.2 材料38-40
• 2.2.1 实验材料38-39
• 2.2.2 实验试剂39
• 2.2.3 实验仪器39-40
• 2.3 实验方法40-48
• 2.3.1 总RNA和总蛋白的提取40-41
• 2.3.2 cDNA的合成41-42
• 2.3.3 荧光定量PCR42-43
• 2.3.4 Western blotting43-46
• 2.3.4.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)43-45
• 2.3.4.2 转膜45
• 2.3.4.3 Blocking45
• 2.3.4.4 孵育一抗45-46
• 2.3.4.5 洗膜和曝光46
• 2.3.5 AICAR注射46-47
• 2.3.5.1 确定AICAR的浓度46
• 2.3.5.2 40 mM AICAR发挥作用时间点的确定46-47
• 2.3.6 BrdU的标记与检测47-48
• 2.3.7 DAPI染色48
• 2.4 实验结果48-54
• 2.4.1 卵胎生卤虫胚胎发育过程中AMPK-α1 mRNA的表达特征48-49
• 2.4.2 卵胎生卤虫胚胎发育过程中AMPK-α1,-α2和pAMPK-α的特征分析49-51
• 2.4.3 过高浓度的AICAR导致卤虫死亡51-52
• 2.4.4 注射后第24小时为AICAR最佳作用时间52
• 2.4.5 AMPK磷酸化水平升高抑制细胞有丝分裂52-54
• 2.5 小结与讨论54-56
• 第三章 AMPK-α1和-α2在卤虫休眠胚胎重新发育过程中表达及活性特征的分析56-64
• 摘要56
• 3.1 引言56-57
• 3.2 材料57
• 3.2.1 实验材料57
• 3.2.2 实验试剂57
• 3.2.3 实验仪器57
• 3.3 实验方法57-60
• 3.3.1 卤虫休眠胚胎的孵化57-58
• 3.3.2 提取总蛋白58
• 3.3.3 Western blotting58
• 3.3.4 BrdU参入实验58
• 3.3.5 BrdU的检测58
• 3.3.6 DAPI染色58-59
• 3.3.7 基于DSS交联的免疫沉淀(IP)59-60
• 3.4 实验结果60-63
• 3.4.1 卤虫活化的休眠胚胎发育过程中AMPK-α1,-α2和p AMPK-α的特征分析60-61
• 3.4.2 休眠胚胎的发育与细胞有丝分裂61-62
• 3.4.3 AMPK-α1和-α2一起调控了卤虫休眠胚胎的发育及细胞的有丝分裂62-63
• 3.5 小结与讨论63-64
• 第四章 LKB1蛋白激酶基因的分子克隆和表达特征64-78
• 摘要64
• 4.1 引言64-65
• 4.2 材料65
• 4.2.1 实验材料65
• 4.2.2 实验试剂65
• 4.2.3 实验仪器65
• 4.3 实验方法65-73
• 4.3.1 总RNA的抽提65
• 4.3.2 cDNA的合成65
• 4.3.3 卤虫LKB1蛋白激酶基因的分子克隆65-73
• 4.3.3.1 简并引物的设计65-66
• 4.3.3.2 PCR扩增66-67
• 4.3.3.3 巢式PCR产物的连接,转化和测序67-68
• 4.3.3.4 [5’和3’RACE PCR]68-72
• 4.3.3.5 卤虫LKB1激酶基因全长的克隆72-73
• 4.3.4 卤虫LKB1蛋白激酶氨基酸序列与其它物种LKB73
• 4.3.5 进化树构建73
• 4.3.6 荧光定量PCR73
• 4.4 实验结果73-77
• 4.5 小结与讨论77-78
• 第五章 LKB1-AMPK-α1调控了卤虫胚胎发育过程中的有丝分裂78-88
• 摘要78
• 5.1 引言78-79
• 5.2 材料79
• 5.2.1 实验材料79
• 5.2.2 实验试剂79
• 5.2.3 实验仪器79
• 5.3 实验方法79-81
• 5.3.1 LKB1 siRNA的显微注射79-80
• 5.3.2 LKB1基因干涉效率的检测80
• 5.3.2.1 总RNA的抽提80
• 5.3.2.2 cDNA的合成80
• 5.3.2.3 荧光定量PCR80
• 5.3.3 LKB1基因干涉之后休眠胚胎的检测80
• 5.3.4 LKB1基因干涉之后胚胎发育第24小时蛋白的抽提80
• 5.3.5 Western blotting80
• 5.3.6 TUNEL Assay80-81
• 5.4 实验结果81-87
• 5.4.1 降低LKB1基因的表达水平不影响卤虫胚胎的早期发育81-83
• 5.4.2 LKB1特异性的调控卤虫卵生途径的胚胎发育83-84
• 5.4.3 LKB1-AMPK-α1调控了卤虫胚胎发育过程中的有丝分裂84-86
• 5.4.4 LKB1基因表达水平的降低导致卵生模式下卤虫早期发育中的胚胎发生细胞凋亡86-87
• 5.5 实验小结与讨论87-88
• 第六章 结论与展望88-89
• 6.1 结论88
• 6.2 展望88-89
• 本研究的创新点89-90
• 参考文献90-101
• 附录一 常用试剂配制一览表101-104
• 附录二 作者学术简历104

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