转HOXA10基因小鼠和猪的制备及基因功能研究

发布时间：2017-05-08 18:16

  本文关键词：转HOXA10基因小鼠和猪的制备及基因功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：繁殖性状是影响养猪生产的重要经济性状之一,其中产仔数是衡量母猪繁殖性状的一个重要指标。提高产仔数的关键在于降低猪胚胎/胎儿死亡率,提高胎儿存活率。而胚胎死亡绝大多数发生在胚胎附植前或附植期间,因此胚胎附植是影响母猪产仔数的关键时期。有研究表明转录因子HOXA10基因(同源异形框A10基因)受雌激素、孕激素调控,高表达于着床窗口期,对胚胎附植的建立、妊娠的维持等具有重要作用。通过转基因技术制备特定时期在特异组织中高表达HOXA10基因的转基因动物,降低胚胎死亡,提高产仔数是我们努力的目标。本研究通过转基因小鼠模型积累实验数据,为制备高繁殖力转基因猪奠定基础;通过转基因克隆技术,以期获得高繁殖潜力的转基因克隆猪,获取新的科研材料;深入了解HOXA10基因在胚胎发育和附植过程中的调控机理,对于提高母猪产仔数具有重要的理论和实践意义。本研究主要研究结果如下:1.采用显微注射法制备转HOXA10基因小鼠,通过Southern及外源插入片段的全长扩增对G0代阳性小鼠进行鉴定。对G2代阳性小鼠的各组织中Hoxa10基因的表达进行检测,发现在肾脏、膀胱和子宫内膜组织中有表达,在心脏、脾脏和卵巢中有痕量表达。G2代母鼠腹腔注射雌激素、孕激素来诱导Hoxa10基因表达,使用Q-PCR及Western blot检测Hoxa10表达的差异,并用Q-PCR检测受Hoxa10调控的下游基因:ETA(内皮素受体A)和Phgdh(磷酸甘油酸脱氢酶),发现这些基因在转基因小鼠和非转基因小鼠中的表达具有差异。统计分析经产胎次的G2代小鼠产仔数,发现转基因小鼠比非转基因小鼠提高产仔数约1只(P=0.08),可以认为转HOXA10基因小鼠的产仔数有增加的趋势。2.对实验室前期获得的6头G0代转HOXA10基因克隆公猪进行传代,产生了56头G1代小猪,经检测有25头为阳性,其中11头雌性。检测G0代转基因克隆公猪12个组织中HOXA10的表达情况。结果显示:HOXA10基因在肾脏、大肠和膀胱中的表达较高;肌肉和淋巴有微弱表达;心脏、肝脏、脾脏、肺脏、脂肪、小肠和睾丸中未检测到表达。3.对4头G0代转基因克隆公猪及部分G1代猪(阳性和阴性)进行血液生理生化指标测定,发现G0代转基因克隆公猪及G1代公猪(阳性与阴性)血小板数目均低于非转基因公猪和文献报道的血小板数目。生化指标中,G0代转基因克隆公猪的睾酮含量低于非转基因公猪,其它指标没有发现异常。4.通过对猪胎儿成纤维细胞进行性别鉴定、脂质体介导转染pc3.1-PF3-HOXA10表达载体、G418筛选、单克隆挑选、PCR检测,建立了4株稳定转染HOXA10的阳性细胞系。5.利用胚胎移植技术,核移植其中1株生长状态较好的细胞,成功制备了3头转HOXA10基因克隆母猪。采用Q-PCR和染色体步移技术对转基因克隆母猪的外源基因拷贝数及整合位点进行检测,发现3头猪的拷贝数分别为27.70、19.88、25.26,外源片段可能插入到4号、9号、13号、14号染色体上。6.采用Lnc RNA芯片,分析在Ishikawa细胞(子宫内膜癌细胞株)中过表达HOXA10基因后,引起差异表达的m RNA和Lnc RNA。发现过表达HOXA10基因后,有339个m RNA上调表达,568个m RNA下调表达(Fold Change≥2,P0.05及Q0.05)。对过表达HOXA10基因后差异表达的m RNA进行GO分析,发现上调表达的m RNA主要参与血管发育、细胞粘附、细胞迁移等生物过程;下调表达的m RNA主要参与细胞周期、胞内运输、蛋白核定位等生物过程。进行KEGG通路分析时,发现差异表达基因主要涉及细胞粘附分子、细胞周期等生物学通路。7.对Lnc RNA进行分析,发现过表达HOXA10基因后,引起732个Lnc RNA上调表达,294个Lnc RNA下调表达(Fold Change≥2,P0.05及Q0.05)。对全部Lnc RNA进行亚组分析,共检测到1,514条类似增强子的Lnc RNA,其中有43条上调表达,16条下调表达。在9,987条基因间长链非编码RNA中,有274条上调表达,98条下调表达。通过分析可能与胚胎附植相关的差异表达的m RNA相邻的差异表达的Lnc RNA,来预测与胚胎附植相关的Lnc RNA。
【关键词】：猪 HOXA10 转基因 小鼠 Ishikawa细胞 LncRNA
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S828;Q78
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 缩略词表13-15
• 1 前言15-34
• 1.1 研究问题的由来15-16
• 1.2 胚胎附植16-17
• 1.2.1 猪胚胎/胎儿死亡的原因16-17
• 1.2.2 胚胎附植过程17
• 1.3 HOXA10 基因在胚胎附植过程中的作用17-23
• 1.3.1 HOXA10 基因概述17-18
• 1.3.2 HOXA10 基因与子宫内膜容受性18-19
• 1.3.3 调节HOXA10 基因表达的因子19-20
• 1.3.4 HOXA10 调控的下游基因20-23
• 1.4 HOXA10 基因的其他功能研究23-24
• 1.5 转基因动物研究进展24-29
• 1.5.1 转基因技术与转基因动物24-25
• 1.5.2 转基因猪的应用前景及存在问题25-28
• 1.5.3 转基因克隆技术在转基因猪中的应用28-29
• 1.6 LncRNA的研究进展29-32
• 1.6.1 LncRNA概述29-31
• 1.6.2 LncRNA在家畜中的研究进展31-32
• 1.6.3 LncRNA与胚胎附植32
• 1.7 研究目的与意义32-34
• 2 材料与方法34-62
• 2.1 材料34-41
• 2.1.1 实验动物34
• 2.1.2 细胞样品34
• 2.1.3 载体及菌株34-36
• 2.1.4 主要仪器设备36-37
• 2.1.5 主要试剂及试剂盒37-40
• 2.1.6 主要分子生物学软件及数据库40-41
• 2.2 研究方法41-62
• 2.2.1 本研究技术路线41-44
• 2.2.2 转基因小鼠的制备与检测44-53
• 2.2.3 转基因克隆公猪的传代与检测53-54
• 2.2.4 转基因克隆母猪的制备54-57
• 2.2.5 与HOXA10 表达相关的差异mRNA和LncRNA筛选57-62
• 3 结果62-94
• 3.1 转基因小鼠的制备与检测62-70
• 3.1.1 制备转基因小鼠外源片段的获得62-63
• 3.1.2 G0 代转基因小鼠的检测63-65
• 3.1.3 转基因小鼠的传代及产仔数的观察65-67
• 3.1.4 G2 代转基因小鼠Hoxa10 基因的表达检测67-70
• 3.2 转基因克隆公猪的传代与检测70-77
• 3.2.1 转基因猪的扩繁70
• 3.2.2 转基因克隆公猪HOXA10 基因的组织表达检测70-71
• 3.2.3 G0 代克隆公猪生理生化指标测定71-73
• 3.2.4 转基因G1 代猪生理生化指标测定73-77
• 3.3 转基因克隆母猪的制备与初步鉴定77-83
• 3.3.1 胎儿成纤维细胞的性别鉴定77
• 3.3.2 pc3.1-PF3-HOXA10 载体的线性化及稳转细胞的构建77-80
• 3.3.3 转HOXA10 基因克隆母猪的初步鉴定80-83
• 3.4 与HOXA10 表达相关的差异mRNA和LncRNA功能预测83-94
• 3.4.1 pcDNA3.1(+)/HOXA10 载体构建83
• 3.4.2 Ishikawa细胞的转染及表达检测83-84
• 3.4.3 用于LncRNA芯片杂交的RNA质量检测84-86
• 3.4.4 差异表达的mRNA和LncRNA的聚类分析86-90
• 3.4.5 差异表达mRNA的Gene Ontology与KEGG通路分析90-91
• 3.4.6 LncRNA的子类与亚组分析91-92
• 3.4.7 可能与胚胎附植相关的LncRNA92
• 3.4.8 差异表达mRNA和LncRNA的Q-PCR验证92-94
• 4 讨论94-102
• 4.1 选择猪HOXA10 基因作为目标基因的理由94
• 4.2 转基因动物制备方法的评估94-96
• 4.2.1 显微注射法与体细胞核移植法的比较94-95
• 4.2.2 供体细胞的选择与阳性细胞系的建立95-96
• 4.2.3 胚胎移植96
• 4.3 关于转基因动物的检测方法96-98
• 4.3.1 转基因动物的鉴定方法96
• 4.3.2 外源基因拷贝数及整合位点的检测96-97
• 4.3.3 血液生理生化指标的检测97-98
• 4.4 关于本研究中转基因小鼠部分的讨论98-99
• 4.4.1 关于启动子的选择98-99
• 4.4.2 诱导小鼠Hoxa10 基因表达及产仔数比较99
• 4.5 选择LncRNA芯片进行基因功能研究的讨论99-102
• 4.5.1 LncRNA的研究方法99-100
• 4.5.2 LncRNA芯片结果的讨论100-102
• 5 小结102-104
• 5.1 本研究的主要结论102-103
• 5.2 本研究的创新点与特色103
• 5.3 本研究的不足与进一步工作的设想103-104
• 参考文献104-121
• 攻读学位期间发表论文题录121-122
• 致谢122-124

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

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2 刘忠华;宋军;王振坤;田江天;孔庆然;郑重;尹智;高力;马海濵;孙爽;李玉田;王洪斌;;体细胞核移植生产绿色荧光蛋白转基因猪[J];科学通报;2008年05期

3 刘雪梅;朱桂金;钟刚;;雌、孕激素及肝素结合生长因子对Ishikawa细胞HOXA10基因表达的调节[J];生殖医学杂志;2007年01期

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1 张运海;利用体细胞核移植技术生产猪克隆胚胎的研究[D];中国农业大学;2005年

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本文编号：351643