高产油微藻基于基因组的初级代谢网络重构和代谢流分析

发布时间：2017-05-09 15:14

  本文关键词：高产油微藻基于基因组的初级代谢网络重构和代谢流分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：Chlorella protothecoides是兼性营养的微藻,在异养条件下细胞生长迅速并可以积累大量油脂,可用于规模化培养并作为生物柴油生产原料。目前关于C.protothecoides的基础研究相对滞后,尚不清楚其在不同营养条件下表型差异化的原因以及油脂积累规律。本文将重构C.protothecoides的初级代谢网络,并结合代谢组学和代谢流分析方法,从代谢的角度展开应用基础研究。首先,建立了针对C.protothecoides的代谢物提取和基于LC-MS的测定方法,比较了其在自养和异养条件下的代谢组,发现大部分代谢物发生了显著变化,尤其是糖分解代谢的中间产物在异养时显著上升,同时ATP和还原力等辅因子以及乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A明显增加,表明了异养C.protothecoides旺盛的葡萄糖代谢以及脂肪酸合成活动。自养转异养的代谢轮廓分析显示,游离氨基酸含量逐渐降低,而糖酵解、磷酸戊糖途径和三羧酸循环代谢物含量增加,表明细胞回收自养时积累的蛋白质,将碳骨架用于油脂合成。根据新获得的基因组的注释,重构了C.protothecoides的初级代谢网络,并模拟了不同条件下的生长情况,预测值和实验值吻合良好说明了模型和数据的可靠性。理论最优生长的预测表明当前自养和异养生长速率仍可以分别提高20%和10%。表型相面分析给出了不同条件下C.protothecoides出现最佳生长和相应脂肪酸合成的培养条件,即:自养时光吸收通量与CO2消耗速率之比为8.4左右,异养时葡萄糖利用与O2吸收速率之比为2.7左右。运用同位体非稳态标记方法获得了C.protothecoides自养和异养时代谢物动态标记过程,并以此为额外约束解析了胞内代谢流分布。结果表明自养细胞光呼吸作用可以被其他途径替代,可以完全抑制以减少碳损失,三羧酸循环的作用主要是提供生物质合成前体而非产生能量;异养细胞磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和苹果酸酶代谢活跃,形成C4样通路并可能提供还原力,柠檬酸合成酶与脂肪酸合成竞争碳骨架因此可以被抑制,但同时需要考虑产生能量与还原力的替代途径。利用动态流分析方法解析了C.protothecoides氮代谢特征,发现自养条件下对氨氮的吸收主要通过谷氨酸脱氢酶途径,而异养条件下氮同化几乎完全依赖于谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合成酶催化的偶联反应。C.protothecoides对氮同化途径的选择表现了其应对不同环境压力的自我调节能力。以上结果对C.protothecoides油脂积累机制的研究具有重要的意义,同时为产量优化等应用研究提供了定量化的理论指导。
【关键词】：微藻 代谢组学 代谢网络重构 代谢流分析 油脂
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q949.2
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 主要符号对照表9-11
• 第1章 引言11-30
• 1.1 微藻生物柴油概述11-18
• 1.1.1 生物柴油11-12
• 1.1.2 微藻生物产油的优势12-13
• 1.1.3 微藻生物柴油的生产流程13-17
• 1.1.4 原始小球藻生产生物柴油研究进展17-18
• 1.2 微藻代谢组学研究进展18-21
• 1.2.1 代谢组学简介18-20
• 1.2.2 代谢组学在微藻研究中的应用20-21
• 1.3 微藻代谢网络重构研究进展21-24
• 1.3.1 代谢网络重构简介21-23
• 1.3.2 已完成代谢网络重构的藻类23-24
• 1.4 微藻基于~(13)C标记的代谢流分析研究进展24-28
• 1.4.1 同位体稳态标记25-26
• 1.4.2 同位体非稳态标记26-28
• 1.5 论文研究思路28-30
• 1.5.1 立题依据和意义28
• 1.5.2 研究内容28-29
• 1.5.3 研究路线29-30
• 第2章 自养和异养原始小球藻的代谢组分析30-50
• 2.1 本章引言30
• 2.2 材料与方法30-37
• 2.2.1 化学试剂30
• 2.2.2 藻种与培养30-32
• 2.2.3 生长监测32
• 2.2.4 代谢物提取32
• 2.2.5 LC-MS测定32-34
• 2.2.6 胞内代谢物浓度的绝对定量34-37
• 2.2.7 自养转异养的代谢轮廓分析37
• 2.3 结果37-49
• 2.3.1 基于LC-MS的原始小球藻代谢物测定方法的建立37-40
• 2.3.2 自养和异养原始小球藻的代谢组40-46
• 2.3.3 原始小球藻自养转异养过程的代谢轮廓分析46-49
• 2.4 讨论49
• 2.5 本章小结49-50
• 第3章 原始小球藻中心碳代谢网络重构50-70
• 3.1 本章引言50
• 3.2 材料与方法50-57
• 3.2.1 藻种与培养50
• 3.2.3 生长监测50-51
• 3.2.4 生物质组成测定51-54
• 3.2.5 原始小球藻初级代谢网络重构54-56
• 3.2.6 原始小球藻的生长模拟56-57
• 3.3 结果57-67
• 3.3.1 原始小球藻的初级代谢网络57-59
• 3.3.2 自养和异养原始小球藻的生物质组成59-64
• 3.3.3 自养和异养条件下原始小球藻的生长模拟64-65
• 3.3.4 自养和异养条件下原始小球藻的PhPP分析65-67
• 3.4 讨论67-68
• 3.4.1 基于基因组的原始小球藻代谢网络建模67-68
• 3.4.2 FBA目标函数的选择68
• 3.5 本章小结68-70
• 第4章 原始小球藻的同位体非稳态代谢流分析70-84
• 4.1 本章引言70
• 4.2 材料与方法70-72
• 4.2.1 藻种与培养70
• 4.2.2 ~(13)C标记实验70-71
• 4.2.3 代谢物提取71
• 4.2.4 LC-MS测定71
• 4.2.5 基于动态同位体分布的代谢流分析71-72
• 4.2.6 辅因子平衡分析72
• 4.3 结果72-81
• 4.3.1 自养原始小球藻标记系统的建立72-74
• 4.3.2 自养和异养原始小球藻的动态标记74-77
• 4.3.3 自养和异养原始小球藻的非稳态代谢流分析77-80
• 4.3.4 辅因子平衡分析80-81
• 4.4 讨论81-83
• 4.4.1 同位体非稳态动态流分析结果与FBA结果比较81-83
• 4.4.2 INST-MFA与稳态代谢流分析的比较83
• 4.5 本章小结83-84
• 第5章 原始小球藻氮代谢的动态流分析84-95
• 5.1 本章引言84-85
• 5.2 材料与方法85-88
• 5.2.1 藻种与培养85
• 5.2.2 培养基中氮含量测定85
• 5.2.3 ~(15N)标记实验85
• 5.2.4 代谢物提取85
• 5.2.5 LC-MS测定85
• 5.2.6 原始小球藻的动态流分析85-88
• 5.3 结果88-93
• 5.3.1 原始小球藻氮同化途径中间代谢物的动态标记88-89
• 5.3.2 自养与异养原始小球藻不同的氮同化途径89-92
• 5.3.3 由转氨反应直接生成的其他氨基酸的代谢通量92-93
• 5.4 讨论93-94
• 5.4.1 原始小球藻不同营养条件下氮同化途径的选择93-94
• 5.4.2 KFP测定结果与FBA模拟值的比较94
• 5.5 本章小结94-95
• 第6章 讨论与展望95-100
• 6.1 讨论95-96
• 6.2 结论96-97
• 6.3 本研究创新点97
• 6.4 展望97-100
• 参考文献100-113
• 附录113-173
• 致谢173-175
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果175

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1 吴庆余;;自养小球藻转化为异养代谢生长后细胞的超微结构与相关生化组成[J];南京大学学报(自然科学版);1993年04期

2 詹发萃;邓家齐;夏宜

本文编号：352729