应用膜片钳电生理技术研究多肽毒素对钾离子通道的作用机制

发布时间：2017-05-09 19:20

  本文关键词：应用膜片钳电生理技术研究多肽毒素对钾离子通道的作用机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：离子通道是膜蛋白的一种,它在生命活动中起着非常重要的作用。由于离子通道的一些突变会导致人类疾病,因此相关药理学方面的研究也非常重要。目前对离子通道的研究主要有利用X射线晶体衍射或者液体核磁共振技术解析它们的结构,利用膜片钳电生理技术研究它们的功能等等。动物多肽毒素通常能够作用于离子通道,调节它们的开放和关闭。它们是研究离子通道结构与功能的工具,同时也能被改造或修饰,用于疾病的治疗。本文中我们主要用蛋白异源表达纯化的方法获得多肽毒素,用液体核磁共振技术以及膜片钳电生理技术研究动物多肽毒素和钾离子通道的相互作用。论文共分为四个章节。第一章介绍了钾离子通道和相关动物多肽毒素的基本知识。包括钾离子通道的类型,钾离子通道相关疾病以及多肽毒素的种类、结构,与钾离子通道相互作用模式等。第二章对膜片钳电生理技术作了简单的介绍,包括膜片钳的几种基本模式以及衍生技术,主要的相关设备等。第三章是蜈蚣多肽毒素SSD609对KCNQ1/KCNE1钾离子通道作用机制的研究。作用于KCNQ1/KCNE1钾离子通道的多肽毒素很少,目前只有两篇文章报道过相关内容,蜈蚣毒腺中提取的SSD609就是其中的一种。而KCNQ1/KCNE1钾离子通道与人类心脏疾病密切相关,作用于它的毒素有潜在的作为药物的可能。本章我们通过大肠杆菌异源表达纯化的方法获得较为大量的SSD609多肽毒素,通过膜片钳电生理技术验证其抑制Iks电流的功能,证明其与天然状态的毒素拥有类似的生理功能。之后利用液体核磁共振技术解析了它的结构,由三段α螺旋构成,此结构在动物多肽毒素中非常少见。根据结构和功能提供的信息,猜测其作用于KCNE1辅助亚基,因此设计了KCNE1上相关位点的突变,结合电生理实验推断出SSD609与KCNQ1/KCNE1可能的相互作用方式,首次提出多肽毒素作用于辅助亚基,这为以后进一步的研究打下基础。第四章主要介绍了蝎毒素IbTX的表达纯化以及它对BK钾离子通道的抑制作用。异源表达多肽毒素为一种获取毒素的常用方法,相对来说这种方法时间短、花费少,而且可以对毒素做些简单的改造。融合标签能够帮助多肽毒素表达,但用酶切的方法除去标签时容易引入多余氨基酸残基。本章我们使用两种不同的酶来切除IbTX的融合标签,使用膜片钳电生理技术研究它们对BK钾离子通道的作用,证明有时候多余一个氨基酸会对多肽毒素的功能产生较大的改变。
【关键词】：钾离子通道 多肽毒素 膜片钳 电生理
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q25
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第一章 钾离子通道及离子通道毒素简介11-35
• 1.1 钾离子通道背景介绍11-16
• 1.1.1 钾离子通道简介11-12
• 1.1.2 钾离子通道类型12-14
• 1.1.3 钾离子通道研究现状14-16
• 1.2 钾离子通道毒素16-23
• 1.2.1 多肽毒素简介16-17
• 1.2.2 不同动物来源的钾离子通道毒素17-19
• 1.2.3 钾离子通道毒素与相关疾病的研究现状19-20
• 1.2.4 钾离子通道毒素的结构研究20-23
• 1.3 多肽毒素和钾离子通道的相互作用模式23
• 1.4 本文主要研究内容23-25
• 参考文献25-35
• 第二章 膜片钳电生理技术35-47
• 2.1 膜片钳技术简介35-39
• 2.1.1 膜片钳技术的基本模式35-37
• 2.1.2 膜片钳的其他衍生技术37-39
• 2.2 膜片钳实验相关的设备39-42
• 2.3 膜片钳电生理实验的灌流与给药42-43
• 2.4 膜片钳技术中基本概念简介43-45
• 2.4.1 电流、电压和电阻43-44
• 2.4.2 电导44-45
• 2.4.3 电容45
• 2.5 本章小结45-46
• 参考文献46-47
• 第三章 SSD609对KCNQ1/KCNE1通道的作用机制研究47-93
• 3.1 引言47
• 3.2 背景介绍47-55
• 3.2.1 KCNQ1离子通道简介47-49
• 3.2.2 KCNQ1离子通道的电生理性质49-50
• 3.2.3 KCNQ1/KCNE1通道与相关疾病50-52
• 3.2.4 KCNQ1/KCNE1通道相关多肽毒素研究现状52-53
• 3.2.5 蜈蚣毒素SSD609简介53-55
• 3.3 实验材料和方法55-69
• 3.3.1 实验材料和相关仪器55-56
• 3.3.2 蜈蚣毒素SSD609的表达纯化56-57
• 3.3.3 SSD609蛋白重折叠57
• 3.3.4 质粒构建57-58
• 3.3.5 分子克隆与位点特异性突变58-62
• 3.3.6 细胞培养和质粒转染62-64
• 3.3.7 豚鼠和大鼠心肌细胞的急性分离64-66
• 3.3.8 膜片钳电生理实验66-68
• 3.3.9 膜片钳电生理数据分析68
• 3.3.10 液体核磁共振解析SSD609结构68-69
• 3.4 实验结果和讨论69-82
• 3.4.1 SSD609的表达纯化及二硫键重建69-71
• 3.4.2 SSD609的功能验证71-76
• 3.4.3 SSD609对其他钾离子通道的选择性76-78
• 3.4.4 SSD609的液体核磁共振结构解析78-80
• 3.4.5 SSD609与KCNQ1/KCNE1的相互作用位点研究80-82
• 3.5 本章总结82-86
• 参考文献86-93
• 第四章 IbTX的表达纯化及其对BK通道的抑制作用初探93-113
• 4.1 引言93-94
• 4.2 背景介绍94-98
• 4.2.1 BK钾离子通道简介94-97
• 4.2.2 IbTX多肽毒素简介97-98
• 4.3 实验材料与方法98-101
• 4.3.1 质粒构建98-99
• 4.3.2 IbTX的表达纯化99-100
• 4.3.3 SUMO酶的表达纯化100-101
• 4.3.4 IbTX的环化101
• 4.3.5 细胞培养和质粒转染101
• 4.3.6 膜片钳电生理实验和数据处理101
• 4.4 实验结果与讨论101-108
• 4.4.1 SIbTX的表达纯化以及质谱验证102-104
• 4.4.2 cIbTX的表达纯化以及质谱验证104-107
• 4.4.3 SIbTX和cIbTX对BK钾离子通道的作用107-108
• 4.5 本章总结108-109
• 参考文献109-113
• 致谢113-115
• 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果115

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