小鼠磨牙间充质成牙潜能的关键分子

发布时间：2017-05-19 15:05

  本文关键词：小鼠磨牙间充质成牙潜能的关键分子，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：小鼠磨牙是研究哺乳动物上皮与间充质之间相互作用机制的重要模型。牙发育依赖于来自外胚层的牙上皮和神经嵴来源的牙间充质之间的相互诱导和作用,这种作用是通过两者之间一系列交互而有序的旁分泌生长因子信号传导而实现的。这些信号分子能调控牙胚中基因的表达以及组织细胞的功能,决定牙间充质与牙上皮的牙向分化命运。牙器官的发育过程中,不同时期的牙胚组织还具备诱导牙齿发育潜能,通过特定的分泌型信号分子,可诱导非牙组织牙向分化。深入分析诱导牙齿发育潜能的关键分子组成,对利用干细胞及牙器官的发育原理进行牙齿再生的研究将具有重要的提示,可为干细胞牙向的定向分化提供理论基础。经典重组实验证明,在E9.5天,诱导成牙潜能存在于牙上皮之中,E12.5天之后诱导成牙潜能转移至牙间充质中。E13.5天的牙间充质能诱导E10.5天第二腮弓上皮(非牙源性上皮)发育成为牙齿。但利用这样的重组体系进行牙间充质的诱导成牙潜能的研究效率低下,需要同时收获两个不同时期的胚胎进行重组实验,而且E10.5天第二腮弓上皮较难分离。为了高效地开展牙间充质诱导成牙潜能的研究,本研究将探究在小鼠同期胚胎中是否存在其他的能被牙间充质诱导的非牙源性上皮组织,为牙间充质诱导成牙潜能的研究提供充足而方便制备的非牙源性上皮来源。以小鼠相同胚胎时期的头上皮组织、下颌上皮组织、肢芽上皮组织和背部上皮组织为非牙源性上皮来源,通过大量的重组实验,发现E14.5磨牙间充质组织与E14.5下颌上皮组织的重组组合成牙效率最高(61.9%)。进一步探究E14.5天下颌表皮组织与磨牙间充质组织重组体的发育模式,发现能完全模拟小鼠磨牙的发育模式,E14.5天下颌表皮组织能正常分化成为成釉组织,并分泌釉质。说明E14.5天下颌表皮组织完全可以替代E10.5天的第二腮弓上皮组织用于牙间充质的诱导成牙潜能研究,并具快捷方便性。近年来,干细胞在牙再生研究中的应用越来越广泛。已有研究报道诱导多能干细胞,表皮干细胞以及牙龈上皮干细胞都能够被间充质诱导牙向分化。在本实验室的前期研究中发现人的表皮干细胞也是可以作为一种非牙源性上皮的来源进行小鼠牙间充质的诱导成牙潜能研究,但是也存在成牙效率低下的不足。本研究将在此基础上,将不同比例的表皮干细胞与E13.5天小鼠牙间充质进行重组,探究成牙率最高的细胞比率。通过不同细胞比例的实验,本研究发现人表皮干细胞与E13.5天小鼠牙间充质细胞的比例为1：9时,重组体具有最高的成牙率,达到92.6%,同时也能完全模拟牙齿的发育模式,人表皮干细胞也能分化成为成釉细胞,分泌釉质。本研究建立了一套高效的牙间充质诱导成牙潜能的体系,为后续的诱导成牙潜能的功能研究奠定了基础。许多生长因子在小鼠牙发育过程中各个阶段的表达模式已经得到了充分的研究。生长因子在不同组织的不同发育阶段的诱导成牙潜能中承担非常重要的作用。寻找成牙潜能的分子构成,是揭示成牙潜能的关键所在。本研究为了探究小鼠磨牙诱导成牙潜能的分子构成,首先通过体外器官培养体系,建立了小鼠磨牙间充质诱导成牙潜能的丢失模型。将E14.5天的小鼠磨牙间充质体外分别培养24h,48h小时后,分别与非牙源性表皮重组,发现在培养24小时后,小鼠磨牙间充质诱导成牙能力大幅下降,成牙率仅为19.2%。而在培养48小时后,诱导成牙潜能完全则完全丧失。通过细胞染色发现,培养24小时和48小时后的牙间充质组织未发生坏死和凋亡,因此我们推测在牙间充质体外器官培养过程中,是由于某些基因的表达变化导致了诱导成牙潜能的丢失。本研究进一步利用RNA-Seq分析的方法,将体外培养Oh,24h,48h三个时间的E14.5小鼠磨牙间充质提取总RNA,进行RNA测序,通过系统生物信息学分析,筛选出基因表达量显著下调的基因有99个,同时基因表达量上调的基因有409个。通过GO功能富集分析,最显著富集的GO功能类别为oxygen binding、oxygen transport、oxygen transporter activity、organ development、 binding、cytosolic part、Multicellular organismal development。共富集包含39个基因,其中可能与诱导成牙潜能丢失相关的基因为Fgf3和Sfrp4。因此筛选得到Fgf3、Sfrp4作为诱导成牙潜能相关的候选关键分子。其中,Fgf3的表达水平随间充质组织在体外培养时间的增长而显著下调,Sfrp4在间充质组织在体外培养过程中显著上调。本研究利用CRISPR/Cas9介导的基因功能缺失技术和琼脂糖微球外源蛋白吸附手段,进一步探究Fgf3和Sfrp4是否是调控小鼠牙间充质诱导成牙潜能的关键信号分子。本研究首先选取了与牙齿发育相关的Msxl和Pax9作为阳性对照,筛选了组脱靶率低,敲除效果好的sgRNA。在细胞水平上建立了一套快速筛选sgRNA的方法,并在牙胚重组体系中建立了CRISPR/Cas9介导的慢病毒干扰表达体系。在E13.5天小鼠磨牙间充质细胞中沉默Msxl和Pax9的表达,不能诱导非牙源性的上皮细胞牙向分化,证明我们建立的CRISPR/Cas9介导的基因功能沉默体系有效可行。在E13.5天小鼠磨牙间充质细胞中沉默Fg/3的表达,与非牙源性的上皮细胞重组,探究Fgf3的功能缺失是否导致诱导成牙潜能的丧失,通过慢病毒感染小鼠牙间充质组织,并与非牙源性上皮组织重组。研究表明牙间充质细胞中Fgf3的表达缺失并不会明显下调诱导成牙潜能。在14.5磨牙间充质中敲除sFrp4后体外培养48h,与非牙源性上皮重组,未能挽救诱导成牙潜能。然而,本研究通过琼脂糖微球外源蛋白吸附手段,在E14.5天牙间充质组织中添加外源蛋白FGF3后,与非牙源性上皮组织重组,结果表明外源添加FGF3生长因子能显著挽救牙间充质丢失的诱导成牙潜能,成牙率达到43.8%。综上所述,本研究通过将小鼠磨牙间充质与同时期的不同非牙源性组织重组,以及不同比例人表皮干细胞与小鼠牙间充质细胞的重组,建立了简便研究牙间充质诱导成牙潜能的重组体发育模型。其中E14.5磨牙间充质与E14.5下颌上皮组织的重组成牙率达到61.9%,E13.5磨牙间充质细胞与人表皮干细胞的重组成牙率达到92.6%。利用小鼠牙间充质体外器官培养体系,建立了牙间充质诱导成牙潜能的丢失模型,发现小鼠E14.5磨牙间充质在体外培养24h诱导成牙潜能显著下降,48h后则完全丧失诱导成牙潜能。通过对诱导成牙潜能存在显著差异的间充质组织进行RNA-Seq分析,筛选出了牙间充质诱导成牙潜能的关键分子Fgf3和Sfrp4。最后通过基因的功能缺失和琼脂糖外源蛋白吸附手段,探究筛选得到的关键分子在小鼠磨牙间充质诱导成牙潜能中的作用。成功建立由CRISPR/Cas9介导的慢病毒沉默体系,在磨牙间充质细胞中对Fgf3和Sfrp4分别进行功能沉默,对成牙潜能并无明显影响。而在已丢失诱导成牙潜能的间充质中添加外源蛋白FGF3,能够明显挽救诱导成牙潜能,证明Fgf3是小鼠磨牙间充质诱导成牙潜能的关键分子。
【关键词】：诱导潜能 RNA测序 CRISP/Cas9 Fgf3
【学位授予单位】：福建师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q344
【目录】：

• 中文摘要2-5
• Abstract5-9
• 中文文摘9-15
• 绪论15-29
• 第一章 小鼠磨牙间充质诱导非牙源性上皮牙向分化29-65
• 1.1 引言29-30
• 1.2 材料与方法30-48
• 1.3 结果48-62
• 1.4 讨论62-65
• 第二章 小鼠磨牙间充质成牙潜能关键分子的筛选65-85
• 2.1 引言65-66
• 2.2 材料与方法66-70
• 2.3 结果70-83
• 2.4 讨论83-85
• 第三章 诱导成牙潜能候选关键分子的功能验证85-109
• 3.1 引言85-86
• 3.2 材料与方法86-90
• 3.3 结果90-105
• 3.4 讨论105-109
• 附录1109-113
• 附录2113-115
• 参考文献115-125
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果125-127
• 致谢127-129
• 索引129-131
• 个人简历131-135

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 董蕊,金岩,刘源,赵宇,王容;表皮干细胞在成人及胎儿不同部位皮肤中的比较研究[J];第四军医大学学报;2003年18期

2 ;De novo transcriptome assembly of RNA-Seq reads with different strategies[J];Science China(Life Sciences);2011年12期

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本文编号：378991