基于多组织转录组数据的小鼠lincRNA的鉴定和功能分析

发布时间：2017-05-19 10:14

  本文关键词：基于多组织转录组数据的小鼠lincRNA的鉴定和功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：哺乳动物基因组是普遍转录的,但蛋白编码基因只占这些转录本的一小部分,绝大部分是非编码RNA。非编码RNA在调控基因表达方面有重要的功能。lincRNA作为一类重要的非编码RNA,可以在染色质水平、转录水平和转录后水平等多个层次以诱饵RNA、增强子RNA、核支架、snoRNA的宿主基因、microRNA的前体和竞争内源性RNA等形式来调控基因表达。lincRNA参与了多个生物过程,比如基因印迹、X染色体失活、细胞周期、配子形成、多能细胞的分化发育等。近几年来,lincRNA被发现参与了心脏病、地中海贫血、阿尔茨海默病等多种疾病过程,尤其是与肺癌、胃癌、乳腺癌等多种癌症的发生发展过程关系密切。因此,鉴定lincRNA,构建全面完整的lincRNA数据集,可以为lincRNA的功能和进化研究奠定基础,对癌症的诊断和治疗有重要的意义。本研究分别针对小鼠的SOLiD数据和Solexa数据开发了鉴定lincRNA的流程,并对这些lincRNA的转录活性特征、表达谱和功能等进行了深入研究。采用去核糖体的方法在SOLiD平台上对小鼠的大脑、睾丸和胚胎干细胞进行测序。这些样品的SOLiD数据分别有245,032,381、280,932,595和88,306,412条序列比对到基因组上。根据序列比对结果,按照我们鉴定外显子的流程分别鉴定出395,546、465,149和194,996个外显子。利用refGene来评估这些外显子的准确性,结果显示,有94.12%的refGene外显子被鉴定出来,并且匹配长度达到88.71%。去除在已知数据库中注释的外显子后获得新外显子,结合RNAPII和H3K36me3数据,在大脑、睾丸和胚胎干细胞中分别鉴定出17,931、18,512和6,966个转录本。利用Fantom3中注释的RNA来评估转录本的准确性,结果表明,一对一匹配率为95.62%,匹配长度为70.99%。对这些转录本的转录活性特征进行分析发现,CAGE、 RNAPⅡ、H3K4me3在转录本上游明显富集,H3K36me3在转录本的body区富集,以上结果说明这些新转录本有一定的转录活性,是独立的转录单元。通过利用PhyloCSF预测这些新转录本的编码可能性,然后去除小非编码RNA,最终在大脑、睾丸和胚胎干细胞中分别鉴定出3,329、5,371和1,960个lincRNA。利用我们开发的鉴定lincRNA的流程,从15个小鼠链特异的Solexa转录组数据中共鉴定出11,022个lincRNA(8182个lincRNA基因)。对这些lincRNA进行基因组特征分析发现,与蛋白编码基因相比,lincRNA基因长度短,外显子个数少,外显子长度短；但是在外显子个数相同的情况下,lincRNA基因的基因和内含子长度都比蛋白编码基因长。进一步分析发现,造成lincRNA基因内含子长的原因主要在于lincRNA内含子区含有大量repeat,特别是LTR和LINE比例很高,导致在外显子个数相同的情况下lincRNA基因比蛋白编码基因长。对lincRNA所进行的转录活性分析(包括CAGE、RNAPⅡ、H3K4me3、H3K27me3和H3K36me3等)结果与SOLiD数据鉴定的转录本转录活性结果一致。从表达水平来看,lincRNA基因表达量低,组织特异性强。利用GSEA预测lincRNA的功能,结果表明lincRNA与很多有明确功能分类的蛋白编码基因相关,如信号转导、免疫反应、减数分裂、能量代谢和凝血反应等。每个组织的lincRNA大多与各自的生理功能相关。例如,睾丸中的lincRNA主要与生殖发育相关,包括减数分裂、主要性别特征发育、有性生殖和配子形成等；在大脑中,lincRNA与大脑发育、突触发生、轴突形成和信号转导等有关。为了验证鉴定的lincRNA的真实性,随机选择16个组成型表达的lincRNA和42个组织特异性lincRNA进行RT-PCR实验,大部分lincRNA可以检测到阳性表达。本论文的工作为鉴定和描述lincRNA提供了方法,更重要的是扩展了小鼠的lincRNA数据集,为今后lincRNA的功能研究奠定了基础,为相关的功能实验提供了丰富的候选资源。
【关键词】：新一代测序技术 转录组 非编码RNA lincRNA 小鼠
【学位授予单位】：中国科学院北京基因组研究所
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 专业词汇中英文对照表10-15
• 1 引言15-41
• 1.1 lincRNA概述15-18
• 1.1.1 RNA研究历史15-16
• 1.1.2 lincRNA早期发现16-17
• 1.1.3 lincRNA大规模鉴定17
• 1.1.4 lincRNA功能研究17-18
• 1.2 lincRNA研究方法18-27
• 1.2.1 lincRNA研究方法概述18-19
• 1.2.2 新一代测序技术19-27
• 1.2.2.1 Roche/454测序平台20-21
• 1.2.2.2 Illumina/Solexa测序平台21-24
• 1.2.2.3 ABI/SOLiD测序平台24-27
• 1.3 非编码RNA数据库27-28
• 1.4 lincRNA的功能28-34
• 1.4.1 表观调控29-31
• 1.4.2 转录水平31-32
• 1.4.3 转录后水平32-33
• 1.4.4 其它功能33-34
• 1.5 lincRNA与癌症34-37
• 1.6 lincRNA的研究现状及趋势37-41
• 2 材料与方法41-59
• 2.1 SOLiD实验材料及试剂41-42
• 2.1.1 SOLiD实验材料41
• 2.1.2 SOLiD实验试剂41
• 2.1.3 试剂盒41-42
• 2.2 SOLiD转录组文库构建42-43
• 2.2.1 总RNA提取42
• 2.2.2 rRNA去除42
• 2.2.3 文库构建42-43
• 2.3 ChIP-seq实验方法43-44
• 2.4 公共数据库数据集44
• 2.5 SOLiD数据分析方法44-47
• 2.5.1 rmRNA-seq数据饱和度评估44
• 2.5.2 基于rmRNA-seq数据鉴定外显子和构建基因间区转录本44-45
• 2.5.3 利用ChIP-seq数据鉴定甲基化修饰区间45
• 2.5.4 转录本的外显子和启动子保守性分析45-46
• 2.5.5 鉴定lincRNA46
• 2.5.6 Sense和antisense基因表达相关性分析46-47
• 2.6 Solexa实验材料及试剂47-48
• 2.6.1 实验材料47
• 2.6.2 实验试剂47-48
• 2.6.3 试剂盒48
• 2.7 实验方法48-55
• 2.7.1 大脑总RNA提取48
• 2.7.2 rRNA去除48
• 2.7.3 Solexa strand-specific RNA-Seq文库构建48-53
• 2.7.3.1 DNasel消化及片段化处理48-49
• 2.7.3.2 添加接头49-51
• 2.7.3.3 反转录51
• 2.7.3.4 切胶回收51-52
• 2.7.3.5 PCR扩增52
• 2.7.3.6 用AMPure Beads纯化文库52-53
• 2.7.3.7 上机测序53
• 2.7.4 RT-PCR53-55
• 2.8 下载公共数据库中小鼠RNA-Seq和ChIP-seq数据集55
• 2.9 Solexa数据分析方法55-59
• 2.9.1 序列比对和转录本构建55
• 2.9.2 lincRNA鉴定流程55-56
• 2.9.3 lincRNA基因和蛋白编码基因内含子区repeat分析56
• 2.9.4 lincRNA的转录活性和保守性分析56-57
• 2.9.5 lincRNA邻近蛋白编码基因功能研究57
• 2.9.6 lincRNA的表达谱分析57
• 2.9.7 lincRNA功能预测57-58
• 2.9.8 1incRNA的直系同源序列及共线性直系同源转录本查找58-59
• 3 结果与讨论59-95
• 3.1 SOLiD数据构建转录本59-65
• 3.1.1 鉴定外显子59-62
• 3.1.2 注释新的外显子62-63
• 3.1.3 构建基因间区的新转录本63-65
• 3.2 基因间区新转录本的转录活性特征65
• 3.3 新转录本的分类和功能分析65-73
• 3.3.1 新的蛋白编码基因65-69
• 3.3.2 新的ncRNA69-71
• 3.3.3 内含子区的新转录本71-73
• 3.4 SOLiD结果讨论73
• 3.5 Solexa数据鉴定lincRNA的流程73-74
• 3.6 lincRNA的基因组特征74-75
• 3.7 lincRNA基因的转录活性和保守性75-81
• 3.7.1 lincRNA转录起始位点特征80
• 3.7.2 lincRNA的甲基化修饰80
• 3.7.3 lincRNA的保守性80-81
• 3.8 lincRNA的表达谱81-82
• 3.9 lincRNA的功能82-87
• 3.10 实验验证87-89
• 3.11 Solexa结果讨论89-95
• 4 总结与展望95-97
• 参考文献97-111
• 附录111-117
• 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果117

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