代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产S-腺苷甲硫氨酸

发布时间：2017-05-20 16:12

  本文关键词：代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产S-腺苷甲硫氨酸，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：生物活性物质S-腺苷甲硫氨酸(SAM)广泛存在于生物体内,参与体内核酸、蛋白质和磷脂的合成与代谢,可以改善细胞代谢,对于维护细胞正常代谢必不可少。目前SAM发酵生产菌株主要为酵母菌,酵母的发酵周期较长,通常超过100 h,且发酵过程中要不断添加前体物质L-甲硫氨酸,同时酵母细胞膜壁较复杂,给后期提取及纯化带来困难。为克服这些缺陷,本研究探索了了利用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)合成SAM的新方法。C.glutamicum可以积累SAM合成的前体物质L-甲硫氨酸,且其基因组已经被测序,因而通过代谢工程系统改造C.glutamicum生产SAM具有理论价值和应用前景。本论文针对C.glutamicum野生型菌株ATCC 13032和异亮氨酸高产菌IWJ001进行了一系列代谢工程改造,提高了其SAM合成水平。主要结论如下:(1)将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、C.glutamicum、大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的SAM合成酶基因在E.coli JM109进行诱导表达,发现C.glutamicum来源的metK和S.cerevisiae来源的基因SAM2编码的SAM合成酶活性比较高。将基因metK和SAM2分别克隆到E.coli-C.glutamicum穿梭载体pDXW-8中,并转化C.glutamicum ATCC 13032。研究发现ATCC 13032/pDXW-8-metK中SAM合成酶MetK过量表达,酶活为7.9 U·g-1,SAM产量为97 mg·L-1,是对照菌ATCC 13032/pDXW-8的5.27倍。而ATCC 13032/pDXW-8-SAM2不能表达SAM2编码的SAM2,与对照相比无酶活及SAM产量的提高。(2)首先针对ATCC 13032/pDXW-8-SAM2菌株,RT-PCR和SDS-PAGE分析发现SAM2基因可转录但不能翻译。为了在C.glutamicum正常表达,通过密码子优化将SAM2序列优化为SAM2C,并转化至C.glutamicum ATCC 13032。结果显示ATCC 13032/pDXW-8-SAM2C可以过量表达SAM合成酶,酶活为2.2 U·g-1,SAM产量达105 mg·L-1。然后进行了分批发酵,结果显示ATCC 13032/pDXW-8-metK在分批补料发酵36 h后,SAM产量达316 mg·L-1;而ATCC 13032/pDXW-8-SAM2C在发酵60 h后,SAM积累达239 mg·L-1。将上述菌株的SAM合成酶MetK和SAM2C分别进行分离纯化及酶学性质研究。结果显示MetK和SAM2C最适反应温度均为35 oC,最适反应pH均为8.5,对甲硫氨酸的Km值分别为0.51和1.04 mM,对ATP的Km值分别为2.07和1.99 mM。动力学研究表明MetK和SAM2C对ATP的亲和力相差不大,但前者对甲硫氨酸的亲和力比较高。(3)通过代谢工程构建了一系列SAM高产菌株。首先以C.glutamicum ATCC 13032的突变菌WTQ102出发菌,通过进一步基因敲除构建了菌株WHQ103。WHQ103缺失了编码McbR调控蛋白的基因mcbR、编码高丝氨酸激酶的基因thrB和编码胱硫醚-γ-合酶基因met B,SAM产量为74.3 mg·L-1。然后在WHQ103基础上进一步敲除编码硫同化代谢调控酶的基因Ncgl2640,构建了菌株WHQ104,使SAM产量提高到95.4 mg·L-1。最后在WHQ104中过量表达metK基因和编码透明颤血红蛋白的基因vgb,构建了菌株WHQ104/pJYW-4-metK-vgb;进一步表达甲硫氨酸合成途径上的关键基因metX、metY、抗反馈抑制的homm和lysCm基因,构建了菌株WHQ104/pJYW-4-metK-vgb-metYX-homm-lysCm。发酵结果显示WHQ104/pJYW-4-metK-vgb在36 h可产181.8 mg·L-1 SAM,而WHQ104/pJYW-4-metK-vgbmetYX-homm-lysCm在60 h可产SAM 180.6 mg·L-1。同时发现针对WHQ104/pJYW-4-metK-vgb,添加甲硫氨酸不能进一步提高SAM产量,表明甲硫氨酸供给已非SAM合成的限制性因素,胞内ATP水平可能为限制SAM合成水平的重要因素。(4)通过代谢工程改造构建L-异亮氨酸和SAM联产菌株。在C.glutamicum异亮氨酸高产菌IWJ001中过量表达metK和vgb基因,可实现胞外分泌L-异亮氨酸,及胞内积累SAM。与IWJ001/pDXW-8相比,IWJ001/pDXW-8-metK胞内SAM产量提高了11.65倍,IWJ001/pDXW-8-metK-vgb胞内SAM产量提高了14.95倍。进一步表达丙酮酸激酶、苹果酸:醌氧化酶、苹果酸脱氢酶的编码基因pyk、mqo、mdh,构建菌株IWJ001/pDXW-8-metK-vgb-pyk、IWJ001/pDXW-8-metK-vgb-mqo和IWJ001/pDXW-8-metK-vgb-mdh,但这些菌株SAM产量不及IWJ001/pDXW-8-metK-vgb。IWJ001/pDXW-8-metK-vgb在摇瓶发酵72 h可产0.55 g·L-1 SAM和4.24 g·L-1 L-异亮氨酸,分批发酵72 h,可产0.67 g·L-1 SAM和13.88 g·L-1 L-异亮氨酸。
【关键词】：谷氨酸棒杆菌 S-腺苷甲硫氨酸 SAM合成酶 L-甲硫氨酸 代谢工程
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q936
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 绪论10-21
• 1.1 S-腺苷甲硫氨酸的生理功能10-14
• 1.1.1 转甲基作用10-11
• 1.1.2 转硫基作用11
• 1.1.3 转氨丙基作用11-12
• 1.1.4 S-腺苷甲硫氨酸的临床应用12-13
• 1.1.5 S-腺苷甲硫氨酸的稳定性13-14
• 1.2 S-腺苷甲硫氨酸的生产方法14-15
• 1.2.1 化学合成法14
• 1.2.2 酶促转化法14
• 1.2.3 微生物发酵法14-15
• 1.3 SAM合成酶15-17
• 1.3.1 大肠杆菌（Escherichia coli）SAM合成酶16
• 1.3.2 酵母SAM合成酶16
• 1.3.3 哺乳动物SAM合成酶16-17
• 1.3.4 其它来源的SAM合成酶17
• 1.4 谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）及其SAM合成途径17-19
• 1.5 本论文主要研究内容19-21
• 1.5.1 立题依据和研究意义19
• 1.5.2 研究内容19-21
• 第二章 不同来源SAM合成酶在E. coli和C. glutamicum中表达和活性比较21-35
• 2.1 引言21
• 2.2 材料和方法21-29
• 2.2.1 菌株21-23
• 2.2.2 试剂和仪器23-24
• 2.2.3 培养基和培养条件24-25
• 2.2.4 分子生物学操作25-27
• 2.2.5 重组菌的蛋白表达分析27-28
• 2.2.6 酶活测定分析28
• 2.2.7 发酵参数测定28
• 2.2.8 实时荧光定量PCR28-29
• 2.3 结果和分析29-33
• 2.3.1 不同来源的SAM合成酶蛋白序列比对分析29-30
• 2.3.2 不同来源的SAM合成酶表达载体的构建30
• 2.3.3 不同来源的SAM合成酶在E. coli JM109中诱导表达30-31
• 2.3.4 三种不同野生型C. glutamicum合成SAM能力的比对31-32
• 2.3.5 S. cerevisiae和C. glutamicum来源的SAM合成酶在C. glutamicum中诱导表达32
• 2.3.6 RT-PCR和SDS-PAGE确定SAM2失活的原因32-33
• 2.4 讨论33-34
• 2.5 本章小结34-35
• 第三章S. cerevisiae来源的SAM2基因的优化以及酶学性质研究35-46
• 3.1 引言35
• 3.2 材料和方法35-38
• 3.2.1 菌株、质粒及相关引物35-36
• 3.2.2 试剂和仪器36
• 3.2.3 培养基和培养条件36
• 3.2.4 分子生物学操作36
• 3.2.5 发酵参数测定36-37
• 3.2.6 重组菌的蛋白表达分析及分离纯化37
• 3.2.7 纯化后酶酶活的测定37-38
• 3.3 结果和分析38-44
• 3.3.1 S. cerevisiae来源的SAM合成酶密码子优化38-40
• 3.3.2 SAM2优化基因SAM2C在C. glutamicum中诱导表达40-41
• 3.3.3 ATCC 13032/pDXW8metK和ATCC 13032/pDXW8SAM2C分批补料发酵41
• 3.3.4 优化后S. cerevisiae来源的SAM合成酶和C. glutamicum来源的SAM合成酶表达载体构建41-42
• 3.3.5 两种蛋白的纯化及蛋白的SDS-PAGE分析42-43
• 3.3.6 两种蛋白的最适反应pH和温度分析43-44
• 3.3.7 两种酶的动力学常数分析44
• 3.4 讨论44-45
• 3.5 本章小结45-46
• 第四章 由野生型C. glutamicum ATCC 13032构建从头合成SAM的菌株46-61
• 4.1 引言46
• 4.2 材料和方法46-51
• 4.2.1 菌株、质粒及相关引物46-48
• 4.2.2 试剂和仪器48
• 4.2.3 培养基和培养条件48
• 4.2.4 分子生物学操作48-50
• 4.2.5 发酵参数测定50-51
• 4.3 结果和分析51-58
• 4.3.1 相关表达和敲除质粒的构建51-52
• 4.3.2 通过敲除metB和Ncgl2640基因可以显著降低异亮氨酸的合成同时提高SAM的积累52-53
• 4.3.3 关键酶表达载体的构建53-54
• 4.3.4 在WHQ104中过量表达metK和vgb可以进一步提高SAM的积累54
• 4.3.5 在WHQ104菌表达metYX和hommlyscm可以提高SAM合成54-55
• 4.3.6 在WHQ104串联表达metK-vgb，metYX，homm-lysCm对SAM合成的影响55-56
• 4.3.7 在WHQ104/pJYW4metK-vgb中添加甲硫氨酸和腺嘌呤对SAM积累的影响56-57
• 4.3.8 WHQ104/pJYW4metK-vgb和WHQ104/pJYW4metK-vgb-metYX-hommlyscm的补料分批发酵57-58
• 4.4 讨论58-60
• 4.5 本章小结60-61
• 第五章 构建SAM和异亮氨酸联产的C. glutamicum61-74
• 5.1 引言61
• 5.2 材料和方法61-64
• 5.2.1 菌株、质粒及相关引物61-63
• 5.2.2 试剂和仪器63
• 5.2.3 培养基和培养条件63
• 5.2.4 分子生物学操作63-64
• 5.2.5 重组菌的蛋白表达分析64
• 5.2.6 重组菌的酶活分析64
• 5.2.7 发酵参数测定64
• 5.3 结果和分析64-72
• 5.3.1 表达载体的构建64-65
• 5.3.2 在IWJ001中过量表达metK可以显著提高胞内的SAM产量65-66
• 5.3.3 过量表达vgb基因有利于提高IWJ001胞内SAM的水平66-67
• 5.3.4 辅因子基因过量表达对IWJ001胞内SAM的水平的影响67
• 5.3.5 IWJ001/pDXW8metK-vgb相关蛋白表达及酶活情况67-68
• 5.3.6 添加甲硫氨酸和腺苷可以提高IWJ001/pDXW8metK-vgb内SAM产量68-69
• 5.3.7 共表达SAM2C和vgb可以提高IWJ001胞内SAM的水平69-70
• 5.3.8 共表达homm和lysCm可以提高异亮氨酸产量70
• 5.3.9 IWJ001/pDXW8metK-vgb的分批补料发酵70-72
• 5.4 讨论72-73
• 5.5 本章小结73-74
• 主要结论与展望74-76
• 论文主要创新点76-77
• 致谢77-78
• 参考文献78-86
• 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文86

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