Sulfolobus islandicus CRISPR-Cas病毒防御功能的遗传学分析

发布时间：2017-05-22 18:08

  本文关键词：Sulfolobus islandicus CRISPR-Cas病毒防御功能的遗传学分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：许多细菌和大多数的古菌基因组均编码称作CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat-CRISPR-associated)的获得性免疫系统来抵御病毒或质粒的侵害。CRISPR-Cas系统被分为3个主要类型,I型,II型和III型,又被进一步划分为11个亚型。Sulfolobus islandicus Rey15A编码一个I-A亚型(Cascade)和两个III-B亚型(Cmr-α和Cmr-β)CRISPR-Cas干涉系统,本研究项目开始以前,这些系统中的cas基因的功能未被解析,而且,当时已研究过的Cmr系统被证实在体外切割RNA,但它们的体内RNA切割活性并未被证实。本研究的以S.islandicus Rey15A为研究材料,解析了I-A亚型系统中每个Cas蛋白在CRISPR介导的DNA干涉中的功能,另外,明确地证实了Cmr系统的体内RNA干涉活性。为了分析S.islandicus Rey5A I-A亚型系统中单个cas基因在入侵物免疫过程中的功能,我们构建了S.islandicus Rey5A I-A亚型系统中单个cas基因以及除I-A亚型系统外的其它几个cas基因座的缺失株。对每个缺失株在pre-cr RNA加工及质粒干涉方面的表型进行分析后,结果说明,Cas7,Cas5,Cas6和Cas3为I-A亚型系统介导的DNA干涉所必需的蛋白成分,然而,Csa5及其它几个CRISPR-Cas系统均不参与此过程。Cas6被证实为此菌株中唯一一个负责pre-cr RNA加工的酶,同时Cas7,Cas5和Cas3也介入此过程。Cas7和Cas5分别稳定pre-cr RNA加工中间产物和成熟cr RNA;缺少Cas3后加工中间产物大量积累,但其中涉及的原理目前未知。S.islandicus Rey15A Cmr系统介导的的体内RNA干涉活性的确定是通过构建一个RNA干涉试验来实现的。RNA干涉试验的原理是在质粒上表达一个人工CRISPR(artificial CRISPR;所得到质粒称为p AC质粒),该人工CRISPR含有一个来源于β-糖苷酶编码基因lac S的spacer,因此,从p AC上表达出来的cr RNA能够介导Qg源CRISPR-Cmr系统对lac S信使RNA进行干涉,而干涉效果可以通过检测p AC转化子细胞提取物中残留的β-糖苷酶活性来进行评估。在不同的Cmr基因座缺失株中检测RNA干涉活性结果显示,只有两个Cmr基因座均缺失的突变株失去了RNA干涉能力,说明每个Cmr系统均参与了体内RNA干涉。在spacer的不同位点引入突变并用来构建p AC质粒,通过检测这些突变对RNA干涉活性的影响,一个位于cr RNA 3’端的3 nt长的序列被确定为对RNA干涉活性至关重要。对p AC转化子中未被切割的lac S信使RNA的量用实时定量PCR进行评估的结果进一步证实了Cmr介导的体内RNA切割活性。3’-RACE结果显示,lac S信使RNA中的剪切位点被定位在S1 protospacer序列内,结果还表明,Cmr-α利用尺标原理在测定的(间隔6 nt)位点对RNA进行切割,而Cmr-β则利用序列特异性原理在类似UA(UA,UG或UU)位点切割protospacer RNA。
【关键词】：冰岛硫化叶菌 CRISPR-Cas DNA/RNA干涉 遗传分析
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q933
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 缩略语表10-11
• 1 前言11-46
• 1.1 CRISPR-Cas免疫系统的发现及其功能11-13
• 1.2 CRISPR-Cas系统多样性及其分类13-16
• 1.3 CRISPR-Cas系统介导的病毒防御原理16-43
• 1.3.1 新spacer的获取18-20
• 1.3.2 CRISPR RNA加工20-25
• 1.3.3 Ⅰ型Cascade介导依赖PAM识别的DNA干涉25-34
• 1.3.4 Ⅱ型和Ⅲ-A亚型CRISPR-Cas系统介导的DNA干涉简介34-37
• 1.3.5 Ⅲ-B亚型Cmr系统介导RNA干涉37-43
• 1.4 S islandicus Rey15A中CRISPR-Cas干涉系统43-45
• 1.5 本研究目的45-46
• 2 材料与方法46-58
• 2.1 实验材料46-49
• 2.1.1 菌株与质粒46-48
• 2.1.2 分子生物学实验材料48
• 2.1.3 Sulfolous细胞培养48-49
• 2.2 实验方法49-58
• 2.2.1 Sulfolobus感受态制备及电转化49-50
• 2.2.2 cas敲除质粒及cas缺失株的构建50-51
• 2.2.3 cas互补质粒,DNA、RNA干涉质粒构建51-54
• 2.2.4 Sulfolobus总RNA提取及Northern分析54-55
• 2.2.5 cDNA合成,qPCR及RACE55-56
• 2.2.6 β-糖苷酶试验56-58
• 3 结果与分析58-76
• 3.1 I-A亚型系统中Cas蛋白在pre-crRNA加工及PAM依赖型DNA干涉中功能的遗传学鉴定58-64
• 3.1.1 cas缺失株的构建58-59
• 3.1.2 对Cascis,Cmr-α和Cmr-β是否参与pre-crRNA加工和DNA干涉的确定59-61
• 3.1.3 S islandicus Rey15A I-A亚型CRISPR-Cas系统中Cas6,Cas7,Cas5和Csa5蛋白功能分析61-63
• 3.1.4 Cas3(解旋酶-核酸酶)在pre-crRNA加工及DNA干涉过程中的功能分析63-64
• 3.2 Ⅲ-B亚型Cmr系统介导的RNA干涉的体内分析64-76
• 3.2.1 S.islandicus内源CRISPR系统介导的RNA干涉活性研究64-67
• 3.2.2 pAC质粒表达的crRNA对S.islandicus Rey15A中靶基因表达高效抑制作用的鉴定67-68
• 3.2.3 S1 crRNA 3’端一个3nt序列对Cmr介导的体内RNA干涉重要性的确定68-71
• 3.2.4 S.islandicus中Ⅲ-B亚型Cmr系统介导的基因沉默分析71-72
• 3.2.5 S.islandicus Cmr系统执行的RNA剪切特征的分析72-76
• 4 讨论76-84
• 4.1 关于S.islandicus I-A亚型Cascade的组装76-78
• 4.2 关于S.islandicus CRISPR-Cmr系统介导的干涉复合体对靶RNA的识别78-79
• 4.3 关于6亚基Cmr复合体组装样式和靶RNA切割特征79-81
• 4.4 Cmr-α与Cmr-β能否相互转化?81-82
• 4.5 CRISPR-Cas系统的应用前景82-84
• 参考文献84-97
• 附录97-104
• 附录1-本研究所用引物97-103
• 附录2-Sulfobus培养基基础盐及维他命溶液配方103-104
• 博士期间研究成果104-105
• 致谢105

【共引文献】

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本文编号：386462