核糖体结合蛋白ObgE的结构与功能研究

发布时间：2017-05-25 07:08

  本文关键词：核糖体结合蛋白ObgE的结构与功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：GTP酶是重要的细胞调控因子,它通过GTP/GDP状态间的转换作用于许多生物学过程。Obg是P-loop GTP酶家族的一员,作为一种从细菌到人类都十分保守的GTP酶,Obg参与了许多细胞活动,例如,大肠杆菌中的同源物ObgE(Obg in E.coli)就涉及细胞内两个重要的调控过程,即核糖体组装和严紧反应,但目前这些功能的分子机制尚不明确。本研究利用冷冻电镜单颗粒三维重构方法解析了ObgE与核糖体50S大亚基复合物的结构,接着应用生化手段,阐述了ObgE的生理功能及作用机制。首先,我们利用冷冻电镜研究了50S·ObgE·GMPPNP复合物的三维结构,结构分析表明保守的ObgE N端结构域能够通过模仿tRNA与核糖体的肽基转移酶中心发生特异性的相互作用,这方面性质与I类释放因子的作用机制十分相似。同时,ObgE的结合导致核糖体50S大亚基发生了显著的构象变化,直接破坏了50S与30S结合的结构基础。接着,通过预稳态快速动力学检测的方法,我们证明了ObgE的确是抑制核糖体结合的因子,通过结合于50S大亚基来阻止70S复合物的形成,从而阻止蛋白质翻译的起始。另一方面,ObgE结合50S大亚基以及抑制70S复合物形成的功能均受到鸟苷酸的调控,不仅是GTP和GDP,还包括参与细菌严紧反应调控的鸟苷四磷酸——ppGpp。在结合ppGpp之后,ObgE展现出较强的50S亲和能力,导致核糖体结合和解离的平衡反应向70S复合物解离的方向移动。因此,我们认为ObgE作为特殊的翻译因子与细菌的严紧反应密切相关,这也为未来研究ObgE与核糖体相关(p)ppGpp调控因子的相互作用提供了一些线索。综合已有的报道及本研究获得的结果,我们推测在正常生长条件下,ObgE很可能在50S大亚基组装后期充当质量控制检查点蛋白,监督核糖体的成熟情况。而ObgE更主要的功能则是在特定的饥饿环境下,通过感知(p)ppGpp的水平来判断细胞内的能量状态,从而调控核糖体50S大亚基的量和翻译速度,最终将核糖体组装、翻译与其他生长调控通路联系起来。
【关键词】：ObgE 冷冻电镜 ppGpp 核糖体组装 严紧反应
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q51
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-10
• 主要符号对照表10-11
• 第1章 引言11-44
• 1.1 原核细菌的核糖体11-17
• 1.1.1 原核细菌核糖体的结构11-14
• 1.1.2 原核细菌核糖体的功能14-17
• 1.2 原核细菌核糖体的组装17-22
• 1.2.1 原核细菌核糖体 50S大亚基的体外组装17-19
• 1.2.2 原核细菌核糖体 50S大亚基的体内组装19
• 1.2.3 原核细菌核糖体 50S大亚基的体外组装与体内组装对比19-20
• 1.2.4 原核细菌核糖体组装因子20-22
• 1.3 原核细菌的严紧反应22-25
• 1.3.1 原核细菌的严紧反应概述22
• 1.3.2 RleA和SpoT的结构与功能22-23
• 1.3.3 大肠杆菌的严紧反应调控23-25
• 1.4 Obg蛋白的结构与功能25-33
• 1.4.1 Obg蛋白的结构信息27-29
• 1.4.2 Obg蛋白在核糖体成熟过程中的功能29-30
• 1.4.3 Obg蛋白在严紧反应中的功能30-31
• 1.4.4 Obg蛋白在其他细胞调控过程中的功能31-32
• 1.4.5 真核细菌中Obg的同源蛋白32-33
• 1.5 冷冻电子显微学33-43
• 1.5.1 冷冻电镜概述33-36
• 1.5.2 透射电子显微镜的基本部件及成像原理36-39
• 1.5.3 单颗粒三维重构方法39-41
• 1.5.4 冷冻电子显微学的最新进展41-43
• 1.6 本课题的研究意义43-44
• 第2章 ObgE与核糖体 50S大亚基的相互作用44-54
• 2.1 引言44
• 2.2 实验材料44-45
• 2.2.1 实验仪器44-45
• 2.2.2 实验试剂45
• 2.3 实验方法45-48
• 2.3.1 pET28a-obgE及其突变的质粒构建45-46
• 2.3.2 ObgE及其突变蛋白的表达纯化46-47
• 2.3.3 大肠杆菌核糖体的纯化47
• 2.3.4 ObgE与核糖体 50S大亚基的结合47-48
• 2.3.5 ObgE与核糖体 70S复合物的结合48
• 2.4 实验结果48-52
• 2.4.1 ObgE蛋白的纯化48
• 2.4.2 核糖体 50S大亚基纯化结果48-49
• 2.4.3 ObgE与核糖体 50S大亚基的结合49-51
• 2.4.4 ObgE与核糖体 70S复合物的结合51-52
• 2.5 分析讨论52-54
• 第3章 ObgE与核糖体 50S大亚基复合物的冷冻电镜结构54-74
• 3.1 引言54
• 3.2 实验材料54
• 3.2.1 实验仪器54
• 3.2.2 实验试剂54
• 3.3 实验方法54-63
• 3.3.1 50S·ObgE的冷冻电镜样品制备54-56
• 3.3.2 冷冻电镜照片收集56-59
• 3.3.3 冷冻电镜数据处理59-62
• 3.3.4 分子动力学模拟和原子模型搭建62-63
• 3.4 实验结果63-72
• 3.4.1 ObgE·GMPPNP和核糖体 50S大亚基的冷冻电镜结构63-68
• 3.4.2 ObgE N端结构域与转肽反应中心的相互作用68-71
• 3.4.3 ObgE的N端结构域的形状模仿A位点tRNA的接受臂71-72
• 3.5 分析讨论72-74
• 第4章 ObgE在核糖体组装过程及严紧反应中的作用74-95
• 4.1 引言74
• 4.2 实验材料74-75
• 4.2.1 实验仪器74
• 4.2.2 实验试剂74-75
• 4.3 实验方法75-81
• 4.3.1 细菌生长速率测定75
• 4.3.2 核糖体组成分析75
• 4.3.3 共沉淀实验75-76
• 4.3.4 表面等离子体共振实验76-79
• 4.3.5 核糖体 70S复合物拆分79
• 4.3.6 核糖体组装动力学79-80
• 4.3.7 二肽合成80
• 4.3.8 体外翻译实验80-81
• 4.3.9 GTP酶活性测定81
• 4.4 实验结果81-93
• 4.4.1 ppGpp促进ObgE与核糖体 50S大亚基的结合81-84
• 4.4.2 ObgE促进核糖体 70S复合物的解离84-86
• 4.4.3 ObgE是依赖核糖体 50S大亚基的抑制结合因子86-91
• 4.4.4 ObgE是一个与众不同的核糖体依赖GTP酶91-93
• 4.5 分析讨论93-95
• 第5章 ObgE、SpoT与核糖体 50S大亚基的关系95-104
• 5.1 引言95
• 5.2 实验材料95
• 5.2.1 实验仪器95
• 5.2.2 实验试剂95
• 5.3 实验方法95-98
• 5.3.1 pETDuet-spoT-obgE质粒的构建95-96
• 5.3.2 SpoT和ObgE的共表达及SpoT的纯化96
• 5.3.3 SpoT与核糖体 50S大亚基的结合96-97
• 5.3.4 SpoT、ObgE二者与核糖体 50S大亚基的结合97
• 5.3.5 50S·SpoT的冷冻电镜样品制备97-98
• 5.4 实验结果98-102
• 5.4.1 SpoT和ObgE的共表达及SpoT的纯化98-99
• 5.4.2 SpoT与核糖体 50S大亚基的结合99
• 5.4.3 SpoT、ObgE二者与核糖体 50S大亚基的结合99-101
• 5.4.4 SpoT与核糖体 50S大亚基复合物的冷冻电镜结构101-102
• 5.5 分析讨论102-104
• 第6章 讨论与展望104-111
• 6.1 讨论104-110
• 6.1.1 ObgE在核糖体 50S大亚基组装方面的作用104-106
• 6.1.2 GTP酶在核糖体 50S大亚基组装时期的作用顺序106-109
• 6.1.3 ObgE作为抑制结合因子在严紧反应中发挥重要作用109
• 6.1.4 ObgE的功能与其他细胞通路的联系109-110
• 6.2 展望110-111
• 参考文献111-124
• 致谢124-126
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果126

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本文编号：392991