水稻OsLIR1维持叶绿体功能的机制及OsEXPB2参与水稻根系发育的功能研究

发布时间：2017-05-25 08:30

  本文关键词：水稻OsLIR1维持叶绿体功能的机制及OsEXPB2参与水稻根系发育的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：水稻是单子叶植物的模式植物,同时也是世界上最重要的粮食作物之一。本文主要研究水稻OsLIR1维持叶绿体功能的机制及OsEXPB2在水稻根系发育中的作用。叶绿体是植物完成光合作用的主要场所,在类囊体膜系统中,捕光复合体结合叶绿素分子,形成色素-蛋白复合体,参与光能捕获,形成ATP形式的能量。当植物进入衰老阶段,捕光复合体和色素分子分离,叶绿体降解,叶片变黄,进而营养物质从老叶向新叶和种子转移。叶片早衰是植株提前进入衰老阶段的表现,严重影响植物的光合作用和营养物质的转运,从而导致植株的生长受阻。因此,研究水稻光诱导基因维持叶绿体稳定性的机理对进一步了解水稻叶绿体功能具有重要理论意义,同时也可为农业生产提供有应用价值的候选育种基因。OsLIR1,是一个光诱导基因,编码含有128个氨基酸的蛋白,蛋白分子量为13.317 kDa。本文通过RNA干扰技术和蛋白互作分析对该基因的功能进行了系统性研究,主要结论如下:①OsLIR1编码的蛋白定位于叶绿体中,且可能是一个类囊体腔蛋白构建了35S::OsLIR1-GFP融合表达载体,瞬时转化烟草原生质体,激光共聚焦显微镜观察瞬时表达绿色荧光的原生质体,结果发现OsLIR1定位于叶绿体中。通过植物质体数据库(PPDB)在线分析,发现OsLIR1和拟南芥光调蛋白AT3g26740.1的蛋白序列同源性高达59%,而该蛋白是一个类囊体腔蛋白。同时,使用ChloroP和TMHMM server 2.0在线软件预测OsLIR1蛋白不是一个跨膜蛋白,并且N端含有35 aa的叶绿体信号肽(cTP),因此推测OsLIR1可能是一个类囊体腔蛋白。进一步通过String在线软件预测OsLIR1蛋白的互作网络,发现OsLIR1和多个含有胁迫响应结构域的蛋白互作。可见,OsLIR1蛋白可能在水稻生长发育、光合作用及响应外界胁迫中起重要作用。②OsLIR1的表达具有光周期和节律性,主要集中在植物绿色组织中表达,对多种非生物胁迫响应水稻幼苗在12 h光照/12 h黑暗条件下培养三天,定量PCR结果显示,OsLIR1的表达表现出明显的光周期特性;而在24 h光照/24 h黑暗条件下培养三天,OsLIR1的表达呈现出明显的节律性。OsLIR1在水稻组织中的表达模式分析显示,该基因多在绿色组织中表达,其中以叶片中表达最为丰富,根中的表达最少。在非生物胁迫处理后,OsLIR1的表达量在低温和UV照射下显著升高,而在高浓度NaCl环境下显著降低。③oslir1的下调表达抑制植物的生长,改变叶绿体的内部结构通过rnai技术研究oslir1的下调表达对水稻植株生长发育的影响。结果表明,oslir1下调表达导致水稻植株生长被抑制、叶片早衰、花发育畸形、结实率低等表型。进一步分析发现,oslir1下调表达的转基因株系叶绿素含量较野生型下降,光合效率较野生型显著降低,但最大光化学效率(fv/fm)及psii量子产额(Φpsii)没有明显变化。定量pcr结果显示,叶绿素降解途径关键酶基因的表达显著升高而叶绿体相关功能基因转录水平下降。透射电镜观察叶绿体内部结构发现:与野生型比,转基因植株叶绿体内的类囊体膜分布稀疏,基粒跺叠厚度明显降低。光系统蛋白复合体的研究结果表明,转基因株系的光系统ii超复合体明显解离并消失。这些结果说明oslir1可能是通过影响光捕获复合体的稳定性,降低叶片中的叶绿素含量,最终影响叶绿体的功能。④oslir1在黑暗诱导叶片衰老过程中具有维持类囊体膜稳定性的重要作用黑暗条件下处理4d和6d后,与野生型相比,转基因植株叶片的衰老速度加快,叶绿素含量下降显著,fv/fm和Φpsii迅速下降,叶绿素降解途径关键基因表达明显上升,叶绿体相关功能基因的表达明显下降。叶绿体类囊体膜加速降解,叶绿体迅速瓦解。类囊体膜上光系统ii复合体解离加速,相关系统ii蛋白表达下降明显。以上结果表明,oslir1在黑暗胁迫条件下维持类囊体膜稳定是必不可少的。⑤oslir1和cp29(光系统ii捕获复合体4,lhcb4)相互作用以日本晴水稻全生育期的叶片为材料构建酵母双杂交cdna文库。以oslir1作诱饵蛋白筛选酵母cdna文库,共筛选到包括cp29在内的8个候选互作蛋白。酵母共转化结果发现,oslir1和cp29在酵母体内互作;bifc(双分子荧光互补)结果发现oslir1和cp29在烟草表皮细胞内的叶绿体中互作;pull-down结果也证明oslir1和cp29在体外是互作的。oslir1和cp29的互作从机理上阐述了该蛋白在维持光系统ii超复合体结构中的重要作用,在一定程度上解释了转基因植株叶片出现早衰的原因。上述结果表明oslir1是一个影响叶绿体结构和功能的光调蛋白。另一个在植物生长发育中起到重要作用的是膨胀素基因。膨胀素具有诱导细胞壁膨胀的能力,是调控植物生长发育的重要因子之一,但在水稻中关于膨胀素基因功能的报道还比较少。在本文中,研究了一个水稻β亚族膨胀素基因osexpb2的功能,主要结果如下:①多重序列比对分析表明osexpb2含有β亚族特有的保守序列,进化分析发现osexpb2和其它物种的膨胀素β亚族蛋白在进化上聚为一个大分支;②构建35S::OsEXPB2-GFP亚细胞定位载体,瞬时转化洋葱表皮细胞,结果发现该蛋白定位在细胞壁上;③OsEXPB2集中在水稻根中表达,且在营养缺乏胁迫条件下,受缺铁、缺磷环境的诱导表达,在激素处理下,该基因的表达受激素ABA的抑制;④转基因实验结果发现,OsEXPB2的表达下调显著降低了主根长度和根系直径,根毛发育也受到严重影响,进而影响地上部的株高和叶宽。上述结果表明,OsEXPB2是一个在根中大量表达的基因,在水稻根毛发育和根系形态建成过程中起关键作用,为农业生产中根系育种改良提供了一个有应用价值的候选基因。
【关键词】：水稻 叶绿体 OsLIR1 OsEXPB2 根发育
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 中文摘要3-6
• 英文摘要6-14
• 1 绪论14-30
• 1.1 研究背景14-27
• 1.1.1 光信号传导途径14-19
• 1.1.2 类囊体膜系统19-22
• 1.1.3 叶绿素代谢途径22-24
• 1.1.4 膨胀素的研究进展24-27
• 1.2 研究内容和研究目的27-30
• 1.2.1 研究意义及目的27-28
• 1.2.2 主要研究内容28-29
• 1.2.3 技术路线29-30
• 2 OsLIR1下调表达的转基因植株表现出叶片早衰等多种表型30-54
• 2.1 引言30
• 2.2 材料和方法30-36
• 2.2.1 材料及生长条件30-32
• 2.2.2 干扰载体构建32-34
• 2.2.3 生物信息学分析34
• 2.2.4 遗传转化34
• 2.2.5 基因表达特性分析34-35
• 2.2.6 胁迫处理35
• 2.2.7 叶绿素含量和光合参数测定35
• 2.2.8 叶绿体类囊体膜蛋白的提取35
• 2.2.9 蓝绿温和电泳35
• 2.2.10 原生质体制备，转化和瞬时检测35
• 2.2.11 透射电镜（TEM）35-36
• 2.2.12 统计分析36
• 2.3 结果36-52
• 2.3.1 OsLIR1的蛋白互作网络预测36-37
• 2.3.2 OsLIR1的表达特性37-41
• 2.3.3 OsLIR1的亚细胞定位41-42
• 2.3.4 OsLIR1下调表达转基因植株的获得和表型分析42-45
• 2.3.5 OsLIR1的下调表达影响了植株的叶绿素含量45-47
• 2.3.6 OsLIR1的下调表达影响叶绿体亚细胞结构的变化47-48
• 2.3.7 OsLIR1的下调表达影响叶绿素代谢相关基因的表达48-51
• 2.3.8 OsLIR1的下调表达影响了内囊体膜复合体的稳定性51-52
• 2.4 讨论52-53
• 2.4.1 OsLIR1具有光周期和节律性52
• 2.4.2 OsLIR1是影响水稻生长发育的一个重要基因52-53
• 2.4.3 OsLIR1影响水稻叶绿体的发育和功能53
• 2.5 小结53-54
• 3 Os LIR1的下调表达在黑暗条件下加速了水稻叶片的早衰和叶绿体的瓦解54-66
• 3.1 引言54-55
• 3.2 方法55
• 3.2.1 植物生长条件55
• 3.2.2 黑暗处理方法55
• 3.2.3 叶绿素含量的测定和光合参数的检测55
• 3.2.4 透射电镜观察叶绿体结构55
• 3.2.5 相关基因转录水平上的定量分析55
• 3.2.6 BN-PAGE和Western Blot分析55
• 3.3 结果55-63
• 3.3.1 OsLIR1下调表达在黑暗诱导后加速植株叶片衰老和低的光化学效率55-56
• 3.3.2 OsLIR1的下调表达在黑暗条件下加速植株叶绿体的降解56-58
• 3.3.3 黑暗诱导条件下，，OsLIR1下调表达的植株中参与叶绿素代谢相关基因的表达分析58-61
• 3.3.4 OsLIR1的下调表达在黑暗条件下降低植株光合复合体的稳定性61-63
• 3.4 讨论63
• 3.4.1 OsLIR1下调表达加速植株在黑暗诱导下的叶绿素降解和叶片衰老63
• 3.4.2 OsLIR1在叶绿素蛋白复合体稳定性和叶绿体降解中的重要角色63
• 3.5 本章小结63-66
• 4 酵母双杂交文库的构建和Os LIR1互作蛋白分析66-82
• 4.1 引言66
• 4.2 材料和方法66-74
• 4.2.1 材料及培养条件66-67
• 4.2.2 酵母双杂交cDNA文库的构建67-70
• 4.2.3 酵母双杂交筛选70-71
• 4.2.4 酵母质粒的提取71-72
• 4.2.5 小量LiAc酵母转化72-73
• 4.2.6 BiFC载体构建及转化烟草叶片表皮细胞73-74
• 4.2.7 Pull down体外蛋白互作74
• 4.3 结果74-80
• 4.3.1 酵母双杂交cDNA文库的构建74-75
• 4.3.2 OsLIR1和OsCP29蛋白互作75-78
• 4.3.3 BiFC和Pull down验证78-80
• 4.4 讨论80-82
• 5 OsEXPB2影响水稻植物根系的形成和地上部的生长发育82-94
• 5.1 引言82
• 5.2 方法82-84
• 5.2.1 材料和生长条件82-83
• 5.2.2 OsEXPB2的生物信息学分析83
• 5.2.3 载体构建83
• 5.2.4 定量PCR分析83
• 5.2.5 胁迫处理83-84
• 5.2.6 亚细胞定位84
• 5.2.7 电镜和组织切片分析84
• 5.2.8 统计分析84
• 5.3 结果84-91
• 5.3.1 OsEXPB2的鉴定和启动子分析84-87
• 5.3.2 OsEXPB2的亚细胞定位87
• 5.3.3 OsEXPB2的表达模式分析87-89
• 5.3.4 OsEXPB2对植物根系建成的影响89-91
• 5.4 讨论91-92
• 5.5 本章小结92-94
• 6 结论和展望94-98
• 6.1 结论94-96
• 6.2 本研究的创新点96
• 6.3 论文不足之处及后续工作展望96-98
• 致谢98-100
• 参考文献100-118
• 附录118-134
• A. 作者在攻读学位期间所发表的论文目录118
• B. 作者在攻读学位期间科研项目支撑118-119
• 缩写词119-121
• 培养基及缓冲液配方121-130
• 载体图谱130-134

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本文编号：393215