araf通过不同信号通路的介导调控胚胎早期的胚层形成

发布时间：2017-05-29 18:08

  本文关键词：araf通过不同信号通路的介导调控胚胎早期的胚层形成，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：脊椎动物的胚胎在发育过程中会形成三个具有不同发育命运的胚层。胚层的分化涉及诸多调控因子和信号通路的精密调节。Nodal信号和FGF信号对于中内胚层的诱导和背腹体轴的建立具有十分重要的调控作用。这两条信号通路也相互作用,相互调节以确保胚胎在发育过程中具有合适的信号强度。本课题主要研究了araf基因对斑马鱼胚胎早期胚层分化的调控作用,以及在这一过程中araf基因通过其不同异构体调节Nodal和FGF信号通路的分子机制。本课题首先探究了Araf激酶在斑马鱼胚胎胚层分化中的作用。敲低araf能促进中内胚层的诱导和背部组织的形成。遗传互作的实验显示,过表达全长araf mRNA能拮抗激活的Nodal信号所导致的各胚层标记基因的表达变化。此外,Araf对中内胚层的抑制作用不依赖于其下游Erk的介导。与此同时,一系列在体外细胞系中的生化实验揭示,Araf通过直接磷酸化Smad2调控Nodal/Smad2信号。至此,本课题发现了Raf调控Nodal/Smad2信号的一个新途径。araf基因初级转录本通过选择性多聚腺苷酸化产生异构体—araf tv2,其翻译产物缺失C-端激酶活性区。araf tv2的表达量随着早期胚胎的发育逐渐升高。过表达araf tv2将导致胚胎的发育出现异常,并导致中胚层、内胚层和神经外胚层的标记基因出现明显下调,而使表皮外胚层的标记基因出现明显上调。进一步的实验发现,Araf tv2能直接结合全长Araf,但是却不拮抗全长Araf对TGF-β/Smad2信号的抑制作用。Araf tv2能有效地抑制FGF/MAPK信号,并在胚胎中拮抗过表达FGF配体所导致的下游Erk激活以及相应各胚层标记基因的表达变化。从机制上来看,Araf tv2能与Ras蛋白发生直接的相互作用,并竞争性地拮抗Ras与Raf蛋白的结合,从而阻碍了Ras-Raf-Mek-Erk通路的信号转导。在胚胎中过表达araf tv2能有效拮抗过表达激活型Ras所导致的Erk激活以及相应各胚层标记基因的表达变化。最后,Araf tv2对FGF/MAPK信号的抑制作用是依赖于其与Ras蛋白的相互作用。综上所述,本课题发现了Ras-Raf-Mek-Erk级联反应与Noda/Smad2信号之间相互作用的又一关键基因—araf。araf基因通过其不同的异构体分别作用于Nodal/Smad2信号和FGF/MAPK信号通路,参与调控斑马鱼胚胎早期的胚层分化。
【关键词】：araf Nodal/Smad2 FGF/MAPK 斑马鱼 胚层分化
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q954.4
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-10
• 第1章 引言10-47
• 1.1. 斑马鱼的胚胎发育过程10-16
• 1.1.1. 斑马鱼作为模式生物的优势11-12
• 1.1.2. 斑马鱼胚胎的发育过程12-16
• 1.2. 胚胎发育过程中的图式形成16-27
• 1.2.1. 胚胎三个胚层的形成与发育命运17
• 1.2.2. 胚胎中内胚层的诱导17-24
• 1.2.3. 胚胎背腹轴线的建立24-27
• 1.3. Nodal信号通路27-33
• 1.3.1. Nodal通路的信号转导28-31
• 1.3.2. 调控Nodal信号通路的相关因子31-32
• 1.3.3. Nodal信号在胚胎发育中的重要作用32-33
• 1.4. 成纤维细胞生长因子（FGF）信号通路33-40
• 1.4.1. FGF家族成员33-34
• 1.4.2. FGF通路的信号转导34-37
• 1.4.3. 调控FGF信号通路的相关因子37-38
• 1.4.4. FGF信号在胚胎发育中的重要作用38-40
• 1.5. Raf家族蛋白及其调控40-46
• 1.5.1. Raf蛋白结构及其调控机制40-44
• 1.5.2. Araf蛋白及其研究进展44-46
• 1.6. 本课题的研究目的与意义46-47
• 第2章 材料与方法47-74
• 2.1. 斑马鱼胚胎的获得与培养条件47
• 2.2. 实验相关克隆的构建47-51
• 2.2.1. 研究使用的质粒信息47-48
• 2.2.2. 构建克隆的引物信息48-49
• 2.2.3. 质粒的提取与纯化49-51
• 2.3. 胚胎显微注射51-54
• 2.3.1. 体外转录合成m RNA51-52
• 2.3.2. 吗啉环修饰的反义寡核苷酸（MO）的设计与使用52-53
• 2.3.3. 胚胎显微注射方法53-54
• 2.4. 胚胎整胚原位杂交54-58
• 2.4.1. 探针的制备54-55
• 2.4.2. 原位杂交所需材料与试剂55-57
• 2.4.3. 原位杂交方法57-58
• 2.5. 斑马鱼胚胎总RNA提取和半定量PCR58-60
• 2.5.1. 总RNA提取58-59
• 2.5.2. c DNA的制备59-60
• 2.5.3. 半定量PCR60
• 2.6. 实时荧光定量PCR60-61
• 2.7. 胚胎整胚免疫荧光61-63
• 2.7.1. 整胚免疫荧光所用主要试剂61-62
• 2.7.2. 整胚免疫荧光方法62-63
• 2.8. 胚胎免疫印迹63-64
• 2.9. 细胞培养64-68
• 2.9.1. 细胞系的种类与相关试剂64-65
• 2.9.2. 细胞的培养、传代、冻存与复苏方法65-66
• 2.9.3. 细胞转染66-68
• 2.10. 细胞的双荧光素酶报告基因实验68-69
• 2.10.1. 细胞选择与实验试剂68
• 2.10.2. ARE报告基因实验方法68-69
• 2.10.3. Elk-1 报告基因实验方法69
• 2.10.4. 实验数据的分析69
• 2.11. 细胞蛋白检测的免疫印迹69-72
• 2.11.1. 实验试剂与材料70
• 2.11.2. 免疫印迹实验方法70-72
• 2.12. 免疫共沉淀72-74
• 2.12.1. 免疫共沉淀相关试剂与材料72
• 2.12.2. 免疫共沉淀实验方法72-74
• 第3章 全长Araf拮抗Nodal/Smad2信号介导的中内胚层诱导74-88
• 3.1. 全长Araf激酶抑制中内胚层诱导和背部组织的形成74-79
• 3.1.1. araf基因全长转录本的表达谱74-75
• 3.1.2. 敲低araf促进斑马鱼胚胎中内胚层的诱导75-78
• 3.1.3. 过表达全长araf m RNA抑制中内胚层的诱导78-79
• 3.1.4. 小结79
• 3.2. 全长Araf拮抗Nodal/Smad2信号以抑制中内胚层诱导79-84
• 3.2.1. 全长Araf拮抗胚胎中Nodal信号过表达引起的发育异常80-81
• 3.2.2. 敲低araf部分挽救抑制Nodal导致的发育缺陷81-83
• 3.2.3. 全长Araf对Nodal信号的拮抗作用不依赖于下游的Erk83-84
• 3.2.4. 小结84
• 3.3. 本章总结及讨论84-88
• 第4章 Araftv2拮抗FGF/MAPK信号调控胚胎的胚层分化88-123
• 4.1. Araftv2调控斑马鱼胚胎早期的胚层分化88-92
• 4.1.1. araf tv2在斑马鱼胚胎中的时空表达谱89-91
• 4.1.2. 过表达araf tv2导致胚胎出现发育异常91-92
• 4.1.3. 小结92
• 4.2. Araftv2不拮抗全长Araf对TGF-β/Smad2信号的抑制作用92-99
• 4.2.1. Araftv2能与Araf tv1蛋白结合93-94
• 4.2.2. Araftv2不拮抗全长Araf对TGF-β/Smad2信号的抑制作用94-98
• 4.2.3. 小结98-99
• 4.3. Araftv2在细胞系中和胚胎中拮抗FGF/MAPK通路99-106
• 4.3.1. Araftv2抑制FGF/MAPK信号活性99-101
• 4.3.2. Araftv2拮抗胚胎中激活的FGF/MAPK信号101-103
• 4.3.3. Araftv2拮抗胚胎中过表达FGF所导致的标记基因改变103-106
• 4.3.4. 小结106
• 4.4. Araftv2通过作用于Ras抑制FGF/MAPK信号活性106-118
• 4.4.1. Araftv2与Ras直接相互作用106-108
• 4.4.2. Araftv2拮抗Ras介导的FGF/MAPK信号活性108-114
• 4.4.3. Araftv2特异地作用于Ras水平来抑制FGF/MAPK信号114-116
• 4.4.4. 小结116-118
• 4.5. Araftv2抑制FGF/MAPK信号依赖于其与Ras的互作118-122
• 4.6. 本章总结及讨论122-123
• 第5章 讨论与展望123-130
• 5.1. 本课题的结论与模型123-124
• 5.2. Raf蛋白对于中内胚层发育的调控作用124-125
• 5.3. araf基因表达的调控125-127
• 5.4. Araftv2对TGF-β/Smad2信号的抑制作用127
• 5.5. Araftv2对Ras蛋白的特异作用127-129
• 5.6. 斑马鱼Raf蛋白对FGF信号的转导129-130
• 参考文献130-144
• 致谢144-146
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果146

  本文关键词：araf通过不同信号通路的介导调控胚胎早期的胚层形成，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：405412