桑树成花素FT基因瞬时表达体系构建与功能研究

发布时间：2017-05-29 19:00

  本文关键词：桑树成花素FT基因瞬时表达体系构建与功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：FT基因是开花信号通路的促进因子,是花发育通路的汇集点,整合来自光周期、春化和自主等不同花发育通路的信号,在高等植物花发育中发挥着重要作用。FT基因不仅调节营养生长向生殖生长的转变,还控制着植物的生长节奏、生长与休眠之间的转换。桑树从播种到开花需要3-5年时间,这一漫长幼年期是遗传育种研究的最大障碍,同时也是影响早期桑果产量的主要因素。桑树成花素FT(MaFT)家族基因的表达和功能调控模式,至今没有研究报道。论文围绕MaFT基因在瞬时表达和嫁接桑树中及转化进拟南芥和苜蓿内的功能展开研究。本研究主要结果如下:1.构建pET28a-FT原核表达载体表达FT蛋白,蛋白以包涵体形式存在;利用His标签纯化蛋白,纯化后蛋白通过尿素梯度法,经透析膜进行复性,复性蛋白与弗氏佐剂、弗氏不完全佐剂融合后免疫新西兰家兔,4次免疫后,获得1:512,000高效价抗体。2.构建植物pBE2113-FT-GFP双元表达载体,转化入GV3101,LBA4404农杆菌菌株内。蘸花法转染野生型拟南芥,通过卡那霉素抗性、RT-PCR、免疫蛋白印迹筛选出阳性植株,得到转基因拟南芥。结果发现,转基因拟南芥比野生型拟南芥提早10d左右出现早花现象,且叶片数平均只有5片,而野生型拟南芥平均生长出15个叶片时才开花。试验结果表明,MaFT基因能够促进拟南芥提早开花。3.将携带GUS的pBE2113质粒转化进农杆菌GV3101,LBA4404菌株内,通过优化农杆菌介导的瞬时表达体系,发现在桑叶内,GV3101农杆菌菌株更适合进行瞬时表达;选用OD600分别0.5、1.0、1.7三个菌体浓度进行瞬时表达,发现农杆菌菌体浓度对表达效率影响不大,最终选OD600为0.5作为瞬时表达的菌体浓度;比较不同基因型植株和叶片位置对瞬时表达的影响,结果表明:肉质厚实的新鲜叶片比老叶片更利于瞬时表达效率的提高;组培苗和实生苗影响不大,选用幼龄期的实生苗作为表达对象。在桑树叶片内瞬时表达携带pBE2113-FT-GFP质粒的农杆菌菌株GV3101,倒置荧光显微镜观察显示,在桑树叶片、叶柄,叶茎和顶芽内都发现有绿色荧光;实时定量PCR分析表明,瞬时表达后第4天叶片内FT基因表达量最高,后逐渐下降;蛋白免疫印迹试验表明FT蛋白可以通过筛管从叶片传导到顶芽内。4.为检测桑树FT基因的表达和FT蛋白的传导规律,将1年生实生桑的枝条嫁接于20年生的植株上,实时定量PCR分析嫁接实生桑与同龄未嫁接实生桑叶片和顶芽内的FT在mRNA水平上的变化。结果表明,在同龄未嫁接实生桑叶片内FT相对表达量低,而嫁接三个月后实生桑成熟叶片内的FT相对表达量升高;嫁接一年后实生桑叶片内FT的相对表达量是嫁接当年的2倍,是同龄未嫁接实生桑相对表达量的3倍;两年内未嫁接实生桑叶片内FT表达增加不明显;免疫蛋白印迹试验表明,嫁接一年后,在嫁接实生桑顶芽内未检测到FT蛋白,只在叶片内检测到FT蛋白。综合qRT-PCR与Western blot结果分析,通过嫁接,成年桑树内的FT蛋白传导进嫁接的实生桑内,导致FT蛋白含量升高,表明桑树FT蛋白主要在叶片内表达,FT蛋白可以从供体桑树传导到受体桑树。5.优化农杆菌侵染法转化苜蓿进行稳定表达的条件,得到在共培养时间3天,农杆菌的浓度0.6,Kan的最适筛选压为50 mg/L,Carb最适浓度为500 mg/L时,苜蓿的转化率最高。将桑树FT基因转化进苜蓿内,获得了抗性胚性愈伤组织。对诱导产生的抗性胚状体进行了针对FT和GFP基因的PCR检测,筛选出阳性胚状体,证明FT及GFP基因已整合到了苜蓿基因组中。本研究对于认识桑树开花调控分子机理、促进桑果早期丰产;调控开花基因表达;缩短童期,提早开花;提高育种效率具有重要理论意义和应用价值。由于开花时一个复杂的过程,受自身和外界环境及很多途径的调控以及桑树转基因技术方法的限制。我们的研究还处于起步状态,关于MaFT基因调控桑树成花,休眠等方面的机制还有待于更深一步的研究。
【关键词】：MaFT 桑树 瞬时表达 拟南芥
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-14
• 第一章 文献综述14-28
• 1.1 高等植物成花研究概述14
• 1.2 高等植物成花基因研究进展14-18
• 1.2.1 光周期途径14-15
• 1.2.2 春化途径15-16
• 1.2.3 自主途径16-18
• 1.3 FT基因研究进展18-21
• 1.3.1 FT基因的分子生物学和功能进化18-19
• 1.3.2 FT蛋白的作用模式19
• 1.3.3 FT基因调控开花过程19-21
• 1.3.4 FT基因调控休眠过程21
• 1.4 瞬时表达方法研究进展21-26
• 1.4.1 农杆菌介导的瞬时表达原理22
• 1.4.2 农杆菌介导的方法22
• 1.4.3 影响农杆菌瞬时表达的因素22-25
• 1.4.4 瞬时表达技术的应用25-26
• 1.5 本研究的选题依据与主要研究内容26-28
• 1.5.1 选题依据26-27
• 1.5.2 本研究的主要内容27-28
• 第二章 桑树FT基因原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体的制备28-38
• 2.1 材料28
• 2.1.1 试验材料28
• 2.1.2 试验仪器28
• 2.2 方法28-32
• 2.2.1 桑叶总RNA提取28
• 2.2.2 FT片段的扩增28-29
• 2.2.3 重组载体的构建29-31
• 2.2.4 FT基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的SDS-PAGE分析31
• 2.2.5 重组蛋白的可溶性分析31
• 2.2.6 包涵体纯化及复性31
• 2.2.7 多克隆抗体的制备31-32
• 2.2.8 多克隆抗体的检测32
• 2.3 结果和分析32-36
• 2.3.1 FT基因的PCR扩增32
• 2.3.2 FT基因的T克隆32-33
• 2.3.3 FT基因原核表达载体的构建及鉴定33-34
• 2.3.4 表达产物的SDS-PAGE分析34
• 2.3.5 重组蛋白的可溶性分析及包涵体的纯化34-35
• 2.3.6 纯化后蛋白的复性35
• 2.3.7 复性蛋白的浓度测定35
• 2.3.8 多克隆抗体制备与ELISA检测35-36
• 2.4 讨论36-37
• 2.5 小结37-38
• 第三章 pBE2113-FT-GFP 植物表达载体构建及促进拟南芥开花功能的研究38-47
• 3.1 试验材料与试剂38
• 3.1.1 试验材料38
• 3.1.2 试验仪器38
• 3.2 试验方法38-41
• 3.2.0 pBE2113-GFP载体构建38-39
• 3.2.1 pBE2113-FT-GFP载体构建39
• 3.2.2 农杆菌感受态的制备及质粒的转化39-40
• 3.2.3 拟南芥的种植40
• 3.2.4 转染用农杆菌的准备40
• 3.2.5 转染拟南芥40
• 3.2.6 转基因拟南芥的筛选40
• 3.2.7 转基因拟南芥的RNA提取及RT-PCR检测40-41
• 3.2.8 转基因拟南芥Western blot鉴定41
• 3.2.9 转基因拟南芥植株的表型分析41
• 3.3 结果41-45
• 3.3.1 GFP扩增和pBE2113-GFP载体构建41-42
• 3.3.2 FT的扩增42
• 3.3.3 pBE2113-FT-GFP载体构建42-43
• 3.3.4 转化农杆菌的检测43
• 3.3.5 转基因拟南芥的RT-PCR检测43-44
• 3.3.6 转基因拟南芥Western blot检测44-45
• 3.3.7 拟南芥的抗性筛选45
• 3.4 讨论45-46
• 3.5 小结46-47
• 第四章 利用农杆菌介导的瞬时表达体系研究FT的功能47-59
• 4.1 材料与试剂47-48
• 4.1.1 试验材料47
• 4.1.2 试验所需溶液配制47-48
• 4.1.3 试验仪器48
• 4.2 试验方法48-51
• 4.2.1 用于瞬时转化农杆菌的准备48
• 4.2.2 真空渗透法与注射器渗透法48
• 4.2.3 GUS染色方法与GFP荧光观察48-49
• 4.2.4 瞬时表达条件的优化49
• 4.2.5 桑树FT基因的瞬时表达49-51
• 4.3 结果51-57
• 4.3.1 不同的渗透方法对表达的影响51
• 4.3.2 不同农杆菌菌株对瞬时表达的影响51-52
• 4.3.3 不同菌体浓度对表达量的影响52
• 4.3.4 桑叶的生理状态对瞬时表达的影响52-53
• 4.3.5 不同桑树品种对瞬时表达的影响53
• 4.3.6 桑树FT基因的瞬时表达53-55
• 4.3.7 注射渗透后FT表达量的变化55-56
• 4.3.8 RT-PCR检测FT的表达56-57
• 4.3.9 瞬时表达蛋白的检测57
• 4.4 讨论57-58
• 4.5 小结58-59
• 第五章 FT蛋白在嫁接桑树中的功能59-65
• 5.1 材料与试剂59-60
• 5.1.1 材料59
• 5.1.2 试验试剂59
• 5.1.3 试验仪器59-60
• 5.2 试验方法60
• 5.2.1 嫁接60
• 5.2.2 总RNA提取60
• 5.2.3 Real time PCR60
• 5.2.4 蛋白提取60
• 5.2.5 Western blot检测FT蛋白60
• 5.3 结果60-62
• 5.3.1 Real-time PCR检测嫁接前后FT表达量60-61
• 5.3.2 桑树叶片与顶芽内总蛋白的提取61-62
• 5.3.3 FT蛋白的检测62
• 5.4 讨论62-64
• 5.5 小结64-65
• 第六章 农杆菌介导的MAFT基因转化紫花苜蓿的初步研究65-74
• 6.1 材料与方法65
• 6.1.1 试验材料65
• 6.2 试验方法65-67
• 6.2.1 受体植物材料的准备65
• 6.2.2 培养基中kan有效工作浓度的确定65
• 6.2.3 培养基中抑菌抗生素种类的确定65-66
• 6.2.4 培养基中抑菌抗生素浓度的确定66
• 6.2.5 侵染用农杆菌菌液浓度的确定66
• 6.2.6 农杆菌共培养时间的确定66
• 6.2.7 FT基因转化苜蓿及转基因植株鉴定66-67
• 6.3 结果67-72
• 6.3.1 卡那霉素浓度对愈伤组织形成的影响67-68
• 6.3.2 抑菌抗生素种类对愈伤组织形成的影响68
• 6.3.3 抑菌抗生素浓度对农杆菌的抑制作用68-69
• 6.3.4 农杆菌菌液浓度对愈伤组织形成的影响69-70
• 6.3.5 共培养时间对愈伤组织生长状况的影响70
• 6.3.6 目的基因FT对紫花苜蓿的转化70-72
• 6.4 讨论72-73
• 6.5 小结73-74
• 第七章 总结74-75
• 7.1 结论74
• 7.2 本研究的创新点74
• 7.3 有待进一步研究的问题74-75
• 参考文献75-87
• 附录87-102
• 附录一 试验溶液配制87-94
• 附录二 主要试验方法94-100
• 附录三 Q-PCR相关曲线100-102
• 缩略词102-103
• 致谢103-104
• 作者简介104

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