细胞miRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）复制的相关研究

发布时间：2017-05-29 19:09

  本文关键词：细胞miRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）复制的相关研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)可引起母猪晚期流产和仔猪呼吸疾病等临床症状。由于该病的病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)具有较高的变异性,且可造成持续性感染和免疫抑制,因而疫苗免疫防控比较困难。近年来,越来越多的证据表明宿主细胞micro RNA(mi RNA)是机体先天性/获得性免疫以及宿主-病原体相互作用的复杂网络中不可或缺的调节因子。通过直接结合病毒RNA抑制基因表达或间接作用于某个细胞成分进而影响细胞内通路和调节先天性免疫应答,mi RNA在抗病毒感染和复制方面也扮演了重要的角色。为筛选具有抑制PRRSV复制潜在功效的mi RNA,我们合成了15条mi RNA模拟物,其序列在不同物种之间具有高度保守性,且已有相关文献表明它们在先天性免疫和/或抗病毒方面具有一定功效。本研究利用体外转染mi RNA模拟物或阴性对照后再感染相同剂量病毒的方法鉴定具有抗PRRSV作用的mi RNA,并从病毒学水平、基因组复制水平和蛋白翻译水平证明其抑制作用,并进一步发掘其发挥作用的机制。结果表明,15条候选mi RNA中仅有mi R-26a可以强烈抑制PRRSV的复制。体外过表达mi R-26a对不同毒力、不同基因型的PRRSV毒株均有抑制作用,且作用的强弱与转染剂量在一定范围内呈正相关。突变mi R-26a种子区(Seed Region)可恢复病毒滴度,然而突变种子区以外局域并不影响其抑制作用。通过荧光素酶报告基因试验,我们发现mi R-26a不能直接作用于PRRSV基因组RNA。另一方面,过表达mi R-26a可以显著上调I型干扰素和干扰素刺激基因MX1、ISG15的表达,这表明mi R-26a可能通过调控I型干扰素通路进一步发挥抗PRRSV感染作用。随后,我们利用生物信息学软件预测了PRRSV v JX143基因组上潜在的mi RNA靶位点,结果发现其5’末端第155-162位核苷酸与mi R-130种子区以7mer-m8的结合方式完全互补配对。经序列比对分析,其保守性在21株具有代表性的北美型毒株中达100%,而在3株欧洲型毒株中却并不存在。恰如预料的是,转染mi R-130家族,尤其是mi R-130b可以显著抑制PRRSV的体外复制。我们还发现这种抑制作用表现在多株北美型病毒,而对欧洲株无效。荧光素酶报告试验证明,mi R-130b可以显著降低p GL3-5UTR荧光素酶的活性。同时,mi R-130b不激活PAM细胞中IFN-α和TNF-α中的表达,揭示mi R-130的抗PRRSV作用是通过直接靶向PRRSV特异性的结合位点,而非激活先天性免疫来实现的。另外,作为一种无抗原性的小分子,mi RNA被认为在抗病毒治疗应用中具有潜在功效。通过动物体内试验发现,滴鼻给药mi R-130b可以明显缓解临床症状和病毒血症,同时形成部分免疫保护效果。本论文的最后部分,我们通过深度测序鉴定了PRRSV感染MARC-145细胞后mi RNA表达谱,并进行了差异分析。结果可以看出,类似很多物种,mi R-21是MARC-145细胞中含量最丰富的mi RNA。PRRSV感染后,可以对MARC-145内源的mi RNA表达产生影响。已经确定了多种细胞mi RNA,其表达在PRRSV感染后发生显著改变,其中很多mi RNA在前人研究中与机体先天性免疫等息息相关。这表明,mi RNA可能在PRRSV复制和宿主防御感染中发挥着功能。在PRRSV基因组序列范围内,我们没有找到任何潜在的mi RNA茎环结构存在的证据。根据不同mi RNA在细胞中的表达量,我们选取了六条分别呈高、中、低丰度表达的mi RNA作为研究对象,利用北美型PRRSV全长感染性克隆p APRRS的平台,将mi RNA的反向互补序列插入PRRSV基因组3’UTR中,构建了一系列PRRSV突变体,人工提供了与内源性mi RNA序列完全互补的结合位点。结果发现,插入let-7e结合位点后,可以在转染后显著抑制病毒产生的时间和复制的速率,但遗憾的是突变病毒遗传不稳定。尽管如此,我们还是获得了一定试验数据,插入互补结合位点也不失为利用内源mi RNA抑制PRRSV复制的一个研究思路,可通过更多尝试以寻找一株复制能力较弱且稳定遗传的PRRSV,用于抗病毒治疗的研究。综上所述,本研究为宿主细胞mi RNA与PRRSV复制相互作用提供了三方面的试验数据,证实mi R-26a、mi R-130家族的抗PRRSV作用及其机制,同时构建了PRRSV感染MARC-145细胞后mi RNA表达谱,并对利用细胞内源mi RNA抑制PRRSV复制的策略进行了初步探索。
【关键词】：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 miR-26a miR-130b miRNA表达谱 病毒复制
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-16
• 英文缩略表16-17
• 第一章 绪论17-35
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒概述17
• 1.2 PRRSV病原学研究进展17-22
• 1.2.1 PRRSV基因组结构17-18
• 1.2.2 PRRSV基因组复制与亚基因组转录18-19
• 1.2.3 PRRSV非结构蛋白与结构蛋白19-21
• 1.2.4 PRRSV细胞嗜性与入侵21-22
• 1.3 PRRSV持续性感染与先天性免疫22-24
• 1.4 Micro RNA研究概述24-28
• 1.4.1 Micro RNA的发现与定义24
• 1.4.2 Micro RNA的生物学发生24-25
• 1.4.3 Micro RNA的作用特征25-28
• 1.5 Micro RNA识别及靶基因预测28-29
• 1.6 宿主mi RNA与病毒相互作用29-34
• 1.6.1 病毒感染对mi RNA表达谱的影响30
• 1.6.2 mi RNA对病毒复制的影响30-32
• 1.6.3 利用mi RNA影响病毒嗜性32-33
• 1.6.4 mi RNA与PRRSV33-34
• 1.7 本研究目的和意义34-35
• 第二章 mi R-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制35-57
• 2.1 材料与方法35-47
• 2.1.1 细胞与病毒35-36
• 2.1.2 mi RNA模拟体（mimics）36-37
• 2.1.3 主要试剂37
• 2.1.4 主要仪器37
• 2.1.5 mi RNA mimics转染和病毒多步生长曲线37-38
• 2.1.6 间接免疫荧光试验（IFA）38
• 2.1.7 SDS-PAGE和Western Blotting38
• 2.1.8 RNA分离提取和实时定量PCR（q RT-PCR）38-42
• 2.1.9 荧光素酶报告质粒的构建及荧光素酶试验42-47
• 2.1.10 统计学分析47
• 2.2 结果47-55
• 2.2.1 mi R-26a具有抗PRRSV作用47-49
• 2.2.2 mi R-26a对不同基因型和不同毒力的PRRSV毒株均有抑制作用49-50
• 2.2.3 mi R-26a对PRRSV的抑制作用与剂量相关50-51
• 2.2.4 mi R-26家族在PAM细胞上抑制PRRSV复制51-52
• 2.2.5 种子区序列对于mi R-26发挥抗PRRSV作用是必需的52-53
• 2.2.6 PAM细胞感染PRRSV引起mi R-26a/b上调53
• 2.2.7 mi R-26a不与PRRSV基因组直接结合53
• 2.2.8 mi R-26a上调I型干扰素及干扰素刺激基因的表达53-55
• 2.3 讨论55-57
• 第三章 细胞mi R-130抗PRRSV感染的相关研究57-75
• 3.1 材料与方法57-64
• 3.1.1 细胞、病毒和质粒57
• 3.1.2 试剂和仪器57-58
• 3.1.3 mi RNA的合成58
• 3.1.4 mi RNA转染和病毒多步生长曲线58
• 3.1.5 间接免疫荧光试验（IFA）58
• 3.1.6 SDS-PAGE和Western Blotting58-59
• 3.1.7 RNA分离提取和实时定量PCR（q RT-PCR）59
• 3.1.8 Taqman探针一步法荧光定量RT-PCR59-61
• 3.1.9 mi R-130靶位点的验证61
• 3.1.10 动物体内试验61-64
• 3.2 结果64-73
• 3.2.1 软件预测PRRSV 5’UTR含有mi R-130潜在结合位点64-65
• 3.2.2 mi R-130家族均具有抗PRRSV作用65-66
• 3.2.3 mi R-130b对PRRSV复制的抑制作用最强66
• 3.2.4 mi R-130b抑制PRRSV N蛋白表达66-67
• 3.2.5 mi R-130b抑制作用的强弱与剂量相关67-68
• 3.2.6 mi R-130b对不同北美型PRRSV均有抑制作用68-69
• 3.2.7 mi R-130b直接靶向北美型PRRSV 5’ UTR69-70
• 3.2.8 mi R-130b不激活IFN-α 和TNF-α70-71
• 3.2.9 mi R-130b抗PRRSV感染的体内试验71-73
• 3.3 讨论73-75
• 第四章 利用细胞内源mi RNA影响PRRSV复制的初步探索75-85
• 4.1 材料与方法75-80
• 4.1.1 细胞、质粒与细菌75
• 4.1.2 主要试剂75
• 4.1.3 主要仪器75
• 4.1.4 病毒感染和总RNA提取75-76
• 4.1.5 小RNA深度测序及数据分析76
• 4.1.6 mi RNA选取与引物设计76-77
• 4.1.7 突变病毒构建77-79
• 4.1.8 突变病毒拯救79
• 4.1.9 间接免疫荧光试验（IFA）79
• 4.1.10 病毒多步生长曲线79-80
• 4.1.11 突变病毒传代及测序80
• 4.2 结果80-84
• 4.2.1 深度测序小RNA文库的特征80-81
• 4.2.2 PRRSV感染前后mi RNA表达的差异81-82
• 4.2.3 定位在病毒基因组的vs RNA分布82
• 4.2.4 突变病毒N蛋白检测82
• 4.2.5 突变病毒生长曲线82-83
• 4.2.6 突变病毒遗传稳定性83-84
• 4.3 讨论84-85
• 第五章 全文结论85-86
• 参考文献86-100
• 致谢100-101
• 作者简介101

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