Npu DnaE intein的结构与机理研究和蛋白质双模式成像探针的制备及应用

发布时间：2017-05-31 10:19

  本文关键词：Npu DnaE intein的结构与机理研究和蛋白质双模式成像探针的制备及应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本文分别从结构性质和功能应用的角度对两种蛋白质进行了研究。内容主要分为两个部分：(1)念珠藻Npu DnaE intein的结构解析和剪接机理研究。已报道的所有分裂型intein的结构均是顺式结构,无法提供内含肽准确的信息。我们通过蛋白质共表达的方法制备了Npu DnaE intein的天然复合物,并且解析了第一个分裂型intein的蛋白质结构。根据结构分析和蛋白质突变体的功能研究,发现了NArgg50和cSer35两个氨基酸残基在Npu DnaE intein的反式剪接过程中所发挥的重要作用。(2)GFP36+ -dLBT融合蛋白在荧光和磁共振成像中的应用。我们利用蛋白质工程技术制备了GFP36+ -dLBT融合蛋白探针,同时鉴定了此探针在体外、细胞内和小鼠体内的荧光和磁共振成像效果。结果表明GFP36+ -dLBT融合蛋白不仅保留了两个成像模体的优良特性,还能够通过实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect, EPR)被动靶向肿瘤组织进行荧光和磁共振双成像。第一章是对蛋白质内含肽的简介和综述,介绍了蛋白质的结构和剪接机理。第一节主要包括蛋白质内含肽的发现、分布、命名和分类,第二节阐述了内含肽的一级到三级结构,第三节概括了三类内含肽的剪接机理,第四节总结了内含肽的应用。第二章是Npu DnaE intein的结构和剪接机理研究。我们设计了一个含有两个核糖体结合位点的蛋白质表达体系,成功地制备了具有天然的分裂结构的NpuDnaE intein复合物,解析了首个分裂型intein的蛋白质结构。通过蛋白质结构分析发现,除了已报道的静电相互作用外,我们发现疏水相互作用也是intein相互识别的主要驱动力之一。反式结构显示NArg50和CSer35位于剪接活性中心,能与催化活性氨基酸形成氢键从而促进蛋白质剪接。同时发现,Npu DnaE intein的最后一个氨基酸cAsn36具有独特的侧链构象,它在晶体结构中呈现出的两种空间取向能够分别与Nrgg50和CSer35形成氢键。体外的剪接实验证明,任何一个氨基酸的突变都会导致intein剪接活性的下降,而两个氨基酸的同时突变则会更大程度地抑制剪接速率。此外,NArg50还能和位于N端剪接活性位点的CAsp17形成氢键,从而影响第一步的N-S酰基转移过程。体外剪切实验证明NArg50突变会导致剪切副产物增多以及剪接效率的下降。综上所述,在Npu DnaE intein的剪接过程中,位于非保守区的NArg50不仅参与了Asn的环化过程,提高了反式剪接的速率；还有效地避免了N端剪切副反应的发生,保证了反式剪接的效率。第三章是生物成像的概述和研究进展介绍。第一节概括总结了几种常见的生物成像手段,并对各种方法的优缺点分别进行了比较。第二节介绍了荧光和磁共振双成像探针的研究进展。第四章是GFP36+ -dLBT融合蛋白的制备和功能研究。我们通过蛋白质重组和表达纯化技术制备了GFP36+ -dLBT融合蛋白。体外实验证明GFP36+ -dLBT融合蛋白既保持了GFP的荧光成像特性,又保持了dLBT的磁共振成像性质。同时,由于GFP36+表面带有很多正电荷,也赋予了GFP36+ -dLBT融合蛋白穿透细胞膜进入细胞的能力。小鼠的体内成像结果表明,GFP36+ -dLBT融合蛋白作为一个生物大分子,能够通过EPR效应被动靶向肿瘤组织,从而实现小鼠肿瘤特异性的荧光和磁共振双成像。因此,我们通过蛋白质工程技术简单高效制备荧光磁共振双成像探针的方法,为今后多功能成像探针的制备提供了新的思路。
【关键词】：分裂型蛋白质内含肽 反式结构 Asn环化 剪接机理 融合蛋白 荧光成像 磁共振成像
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q51
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第一部分 Npu DnaE intein的结构和剪接机理研究13-91
• 第1章 蛋白质内含肽简介13-43
• 1.1 蛋白质内含肽概述13-16
• 1.1.1 蛋白质内含肽的发现13
• 1.1.2 蛋白质内含肽的分布13-14
• 1.1.3 蛋白质内含肽的命名14-15
• 1.1.4 蛋白质内含肽的分类15-16
• 1.2 蛋白质内含肽结构16-19
• 1.2.1 蛋白质内含肽的氨基酸残基编号法则16-17
• 1.2.2 蛋白质内含肽的一级结构17-18
• 1.2.3 蛋白质内含肽的高级结构18-19
• 1.3 蛋白质内含肽剪接反应机理19-25
• 1.3.1 蛋白质内含肽的顺式剪接机理20-21
• 1.3.2 蛋白质内含肽的反式剪接机理21-22
• 1.3.3 其他蛋白质内含肽的剪接机理22-25
• 1.4 蛋白质内含肽应用25-32
• 1.4.1 蛋白质内含肽介导蛋白质纯化25-27
• 1.4.2 蛋白质内含肽介导蛋白质骨架环化27-28
• 1.4.3 蛋白质内含肽介导蛋白质标记28-30
• 1.4.4 蛋白质内含肽介导蛋白质同位素标记30-31
• 1.4.5 蛋白质内含肽介导合成特殊蛋白质31
• 1.4.6 蛋白质内含肽作为分子开关调节蛋白质的功能31-32
• 1.4.7 依赖于蛋白质内含肽的生物传感器32
• 1.5 小结32-33
• 1.6 本文的研究内容和意义33-34
• 参考文献34-43
• 第2章 念珠藻Npu PCC73102 DnaE split intein结构和功能研究43-91
• 2.1 引言43-44
• 2.2 实验材料与方法44-60
• 2.2.1 实验材料44-46
• 2.2.2 Npu intein共表达蛋白复合物的制备46-51
• 2.2.3 Npu intein复合物的核磁共振谱图51-52
• 2.2.4 Npu intein复合物的晶体制备和解析52-55
• 2.2.5 剪接和剪切实验蛋白样品制备55-59
• 2.2.6 Npu~N和Npu~C相互作用实验59-60
• 2.2.7 蛋白质剪接和剪切实验60
• 2.3 结果与讨论60-85
• 2.3.1 Npu DnaE split intein复合物结核磁共振结构61-65
• 2.3.2 Npu DnaE split intein复合物晶体结构65-67
• 2.3.3 Npu DnaE split intein相互作用机理67-75
• 2.3.4 保守氨基酸残基对蛋白质剪接的影响75-85
• 2.4 本章总结85-86
• 参考文献86-91
• 第二部分 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白双模态成像体系的研究91-133
• 第3章 生物成像简介91-109
• 3.1 生物成像概述91-97
• 3.1.1 引言91
• 3.1.2 分子成像方法91-97
• 3.2 双模态成像体系97-100
• 3.2.1 引言97
• 3.2.2 钆离子螯合物-有机荧光基团小分子双成像系统97-98
• 3.2.3 钆离子螯合物-无机纳米粒子双成像系统98-99
• 3.2.4 钆离子螯合物-树枝状大分子双成像系统99
• 3.2.5 磁共振造影剂-量子点双成像系统99
• 3.2.6 磁性纳米粒子-荧光双成像系统99-100
• 3.3 本文研究内容及意义100-102
• 参考文献102-109
• 第4章 GFP~(36+)-dLBT双成像蛋白探针的制备及功能研究109-133
• 4.1 引言109-110
• 4.2 实验材料与方法110-116
• 4.2.1 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白制备110-114
• 4.2.2 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白特异性结合钆离子114
• 4.2.3 荧光光谱鉴定GFP~(36+)-dLBT融合蛋白114
• 4.2.4 紫外光谱鉴定GFP~(36+)-dLBT融合蛋白114
• 4.2.5 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白体外MRI信号测试114
• 4.2.6 GFP~(36+)-1L-dLBT融合蛋白体外MRI信号测试114
• 4.2.7 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白体外弛豫效能测试114-115
• 4.2.8 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白癌细胞内的荧光成像115
• 4.2.9 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白癌细胞内的磁共振成像115
• 4.2.10 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白在荷人瘤裸鼠模型的荧光成像115
• 4.2.11 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白在荷人瘤裸鼠模型的磁共振成像115-116
• 4.2.12 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白在荷人瘤裸鼠模型各器官的荧光成像116
• 4.3 结果与讨论116-127
• 4.3.1 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白制备和鉴定116-117
• 4.3.2 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白体外性质鉴定117-121
• 4.3.3 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白细胞水平性质鉴定121-123
• 4.3.4 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白体内性质鉴定123-127
• 4.4 小结127-129
• 参考文献129-133
• 附录一 主要溶液配制133-135
• 附录二 常用实验技术135-143
• 致谢143-145
• 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果145
• 已发表论文145
• 申请中国发明专利145
• 待发表论文145

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