Shewanella oneidensis脂肪酸生物合成及其调控的研究

发布时间：2017-06-11 12:09

  本文关键词：Shewanella oneidensis脂肪酸生物合成及其调控的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：脂肪酸是细菌的细胞膜磷脂的重要组成部分,影响着细菌的生长、代谢等几乎所有的生命活动。Shewanella脂肪酸的生物合成与其适应其生境的能力直接相关,但一直以来由于研究模式系统的缺乏而理解有限。Shewanella oneidensisMR-1(奥奈达希瓦氏菌)是该属的代表菌株,是生理生化以及基因蛋白水平表达调控的研究模式菌。本研究首次就S. oneidensis的脂肪酸合成途径(主要是不饱和脂肪酸合成途径)及其表达调控进行了深入分析和研究。适用于S. oneidensis的蛋白诱导表达和GFP报告系统的构建为课题所需,本研究首先构建了一个能在S. oneidensis中广泛应用的IPTG诱导蛋白表达体系pHGE-Ptac,进而又构建了IPTG诱导的GFP报告系统pHGE-Ptac-GFP。这个诱导表达体系为本研究的顺利开展奠定了基础,在本研究的第三、四、五章都有应用,目前已经广泛应用于S. oneidensis的研究中。S. oneidensis FabR和FadR调控不饱和脂肪酸的有氧和无氧合成途径基因组分析得出结论：与Escherichia coli(大肠杆菌,以下简称E. coli)一样,S. oneidensis含有编码脂肪酸合成关键酶的所有基因。本论文实验表明,与E. coli不一样的是,S. oneidensis不仅含有不饱和脂肪酸合成的无氧途径(基于FabA),还含有一条不饱和脂肪酸合成的有氧途径(基于DesA)。野生型中,基于FabA的无氧合成途径处于主要地位,但FabA途径的缺失会诱导DesA表达增力。S. oneidensis的调控蛋白FabR和FadR都调控不饱和脂肪酸合成的无氧和有氧途径。FabR能结合到fabA和desA的启动子区域,直接抑制FabA和DesA的表达；FadR能结合到fabA启动子区域,直接激活FabA的表达但不直接调控DesA表达。S. oneidensis不饱和脂肪酸合成途径的多样性是其适应不同外界环境的基础。通过GC-MS分析各菌株中的脂肪酸成分和含量,本论文得出结论：FabA或FadR的缺失显著影响细胞内脂肪酸的含量和成分,但两者与野生型相比的差别并不一致。△fabA有氧条件下在LB中的生长有微弱缺陷,△fadR的生长缺陷则非常明显,但两者都能通过外源添加不饱和脂肪酸回复生长。所以,FadR在S. oneidensis的不饱和脂肪酸调控以及细胞生长中起到关键的作用。S. oneidensis FabB功能和表达调控特征的研究不饱和脂肪酸合成的无氧途径中还有一个关键酶FabB。S. oneidensis AfabB在有氧条件下与△fadR一样生长缓慢。FabB的缺失导致C14的积累,C14不能进一步合成C16。导致△fabB生长缺陷的直接原因是C14不能充分延长至C16。△fabB通过增加不饱和脂肪酸C14：1的含量从而增加膜的流动性,△fadR则是通过增加支链脂肪酸iso/antiso-C15:0的含量而增加细胞膜的流动性。FabB的缺失会导致细胞生长缺陷,FabB的过表达则会导致细胞死亡。FabB的表达受FadR的调控但不受FabR的调控。虽然FabA缺失突变株中fabB的启动子活性下降,但是FabA表达量的增加并不能导致fabB启动子活性随之增强。所以FadR对FabB表达的调控并不是通过直接调控FabA的表达而实现的。因此,S. oneidensis FabB的功能及其表达调控与E.coli FabB有区别。S. oneidensis FabB对细胞生长的影响大于FabA对细胞生长的影响。△fabA△desA和△fabB△desA中的细胞色素c蛋白含量明显比野生型少,并且△fabA△desA比△fabB△desA更少。另外,△fabB△desA双敲除突变株菌落长时间培养出现的橘红色小菌落取样测细胞色素c蛋白含量,也发现其含量比△fabB△desA多。本研究的实验结果暗示不饱和脂肪酸对c型细胞色素的生物合成有作用。S.oneidensis △fadR表型的相关研究当△fadR在M1基本培养基中生长时,外源添加油酸不能回复它的生长缺陷。△fadR在M1培养基中的生长缺陷表型是多个基因共同作用的结果,仅仅分析含有FadR结合位点的基因并不能揭示△fadR表型的真正原因。外源添加异亮氨酸能够使△fadR回复其在M1培养基中的生长缺陷。在△fadR中引入△prpB和△prpF能使其在M1培养基中回复部分生长。将PrpC在△fadR中过表达之后,△fadR的生长缺陷得到回复,且能回复到与野生型基本一致。这表明S. oneidensis △fadR的生长缺陷表型与支链氨基酸和甲基柠檬酸循环途径有一定的联系,但具体机制如何,还有待进一步研究。
【关键词】：S.oneidensis 不饱和脂肪酸合成途径 支链脂肪酸 调控蛋白FabR/FadR 生长缺陷 支链氨基酸 甲基柠檬酸循环
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q936
【目录】：

• 致谢6-10
• 摘要10-12
• Abstract12-15
• 1 绪论15-34
• 1.1 Ⅱ型脂肪酸合成途径(FAS Ⅱ)15-23
• 1.1.1 Ⅱ型脂肪酸合成途径(FAS Ⅱ)概述16-19
• 1.1.2 Ⅱ型脂肪酸合成途径(FAS Ⅱ)的功能酶19-21
• 1.1.3 Ⅱ型脂肪酸合成途径(FAS Ⅱ)的产物及其功能21-23
• 1.2 支链脂肪酸的合成途径23-24
• 1.3 不饱和脂肪酸的合成途径24-27
• 1.3.1 不饱和脂肪酸的无氧合成途径24-25
• 1.3.2 不饱和脂肪酸的有氧合成途径25-27
• 1.3.3 多不饱和脂肪酸的合成途径27
• 1.4 细菌脂肪酸合成的调控27-32
• 1.4.1 细菌脂肪酸合成的调控蛋白28
• 1.4.2 E.coli中FadR调控脂肪酸的合成和降解28-30
• 1.4.3 E.coli中FabR调控不饱和脂肪酸的合成30-31
• 1.4.4 P.aeruginosa中Δ9酰基去饱和酶的调控31
• 1.4.5 革兰氏阳性菌中脂肪酸合成的调控31-32
• 1.5 脂肪酸合成途径在S.oneidensis中的研究背景和立项依据32-34
• 2 S.oneidensis中IPTG诱导蛋白表达和GFP报告系统的构建34-47
• 2.1 材料与方法35-39
• 2.1.1 供试菌株、质粒及细胞培养条件35-37
• 2.1.2 构建IPTG诱导表达体系37-38
• 2.1.3 构建和表达GFP融合蛋白38
• 2.1.4 点突变38
• 2.1.5 荧光共聚焦显微镜分析38
• 2.1.6 蛋白表达分析38-39
• 2.1.7 生物信息学和数据分析39
• 2.2 结果与分析39-46
• 2.2.1 适用于S.oneidensis研究的IPTG诱导表达体系的构建39-40
• 2.2.2 适用于S.oneidensis研究的IPTG诱导表达体系的验证40-42
• 2.2.3 IPTG诱导表达GFP融合蛋白体系的构建和验证42-46
• 2.3 讨论46-47
• 3 S.oneidensis FabR和FadR调控不饱和脂肪酸的有氧和无氧合成途径47-68
• 3.1 材料与方法48-55
• 3.1.1 供试菌株、质粒及细胞培养条件48-49
• 3.1.2 突变株和回补质粒的构建49-51
• 3.1.3 基因表达分析51-52
• 3.1.4 脂肪酸含量和成分的测定52-53
• 3.1.5 细菌单杂交试验53-54
• 3.1.6 S.oneidensis FadR的表达和纯化54
• 3.1.7 凝胶阻滞分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay)54-55
• 3.1.8 生物信息学分析55
• 3.2 结果与分析55-65
• 3.2.1 S.oneidensis含有不饱和脂肪酸合成的无氧和有氧两条途径55-58
• 3.2.2 S.oneidensis FabR和FadR调控不饱和脂肪酸合成的无氧和有氧途径58-59
• 3.2.3 S.oneidensis中FabA或FadR的缺失显著影响细胞内脂肪酸的含量和成分59-60
• 3.2.4 S.oneidensis中不饱和脂肪酸无氧合成途径的缺失诱导desA基因表达增加60-62
• 3.2.6 S.oneidensis中FadR直接调控FabA但不直接调控DesA62-64
• 3.2.7 S.oneidensis的FabR直接抑制fabA和desA基因转录64-65
• 3.3 讨论65-68
• 4 S.oneidensis FabB功能和表达调控特征的研究68-80
• 4.1 材料与方法69-71
• 4.1.1 供试菌株、质粒及细胞培养条件69-70
• 4.1.2 突变株和回补质粒的构建70
• 4.1.3 基因表达分析70
• 4.1.4 脂肪酸含量和成分的测定70
• 4.1.5 细胞色素c蛋白染色实验70-71
• 4.1.6 生物信息学分析71
• 4.2 结果与分析71-78
• 4.2.1 S.oneidens fabB(S03072)缺失突变株表型分析71-74
• 4.2.2 S.oneidensis FabB过表达导致细胞死亡74-75
• 4.2.3 FadR调控fabB的转录但FabR不调控fabB的转录75-77
• 4.2.4 FadR对FabB表达的调控并不是通过直接调控FabA的表达而实现的77-78
• 4.3 讨论78-80
• 5 S.oneidensis ΔfadR表型的相关研究80-92
• 5.1 材料和方法81-83
• 5.1.1 供试菌株、质粒及细胞培养条件81
• 5.1.2 突变株和质粒的构建81-82
• 5.1.3 基因表达分析82
• 5.1.4 脂肪酸含量和成分的测定82-83
• 5.1.5 转座子随机插入突变及随机引物鉴定83
• 5.1.6 生物信息学分析83
• 5.2 结果和分析83-90
• 5.2.1 基本培养基M1中添加油酸不能回复S.oneidensis ΔfadR的生长缺陷83-85
• 5.2.2 M1中添加异亮氨酸能回复S.oneidensis ΔfadR的生长缺陷85-87
• 5.2.3 利用转座子技术筛选在M1中ΔfadR生长部分回复的突变株87-90
• 5.3 讨论90-92
• 6 论文总结92-95
• 6.1 主要研究结论92-93
• 6.2 创新之处93-94
• 6.3 不足之处及未来研究方向展望94-95
• 参考文献95-113
• 附件：攻读博士学位期间的主要成果113

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 宁君;湖相沉积物中聚不饱和脂肪酸可作为一种古气候的指示剂[J];地质地球化学;1981年08期

2 张义科;;多不饱和脂肪酸氧化代谢的新途径[J];生命的化学(中国生物化学会通讯);1986年03期

3 李志香,沈翠平;多不饱和脂肪酸对人体的作用[J];生物学通报;1998年01期

4 王利华,霍贵成;ω-3不饱和脂肪酸的生物学作用[J];东北农业大学学报;2001年01期

5 鲍建民;;多不饱和脂肪酸的生理功能及安全性[J];中国食物与营养;2006年01期

6 齐婕;尹桂香;罗红;;植物油多不饱和脂肪酸对机体健脑作用的研究[J];北华大学学报(自然科学版);2007年04期

7 李淑梅;白献晓;闫明田;陈建伟;;微生物生产多不饱和脂肪酸的研究进展[J];河南农业科学;2008年07期

8 胡亚平;吴刚;张丽;卢长明;;长链多不饱和脂肪酸的替代来源——转基因油料作物[J];生物技术通报;2009年06期

9 臧俊猛;;ω-3多不饱和脂肪酸的临床药理研究进展[J];科协论坛(下半月);2010年08期

10 ;“2013多不饱和脂肪酸与代谢国际研讨会”通知(上海)[2013年6月3-4日][J];生命科学;2013年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 呙于明;贺喜;龙芳羽;;多不饱和脂肪酸营养对免疫的调节作用与机理[A];动物营养研究进展——中国畜牧兽医学会动物营养学分会第八届全国代表大学暨第十届学术研讨会论文集[C];2008年

2 龚阳敏;江木兰;万霞;梁焯;胡传炯;郭兵;张军平;刘姣;;微生物超长链多不饱和脂肪酸和油脂的合成及利用[A];第四届全国微生物资源学术暨国家微生物资源平台运行服务研讨会论文集[C];2012年

3 袁晓伟;孙全喜;李新征;亓宝秀;;异源长链多不饱和脂肪酸对拟南芥生理功能的影响[A];第六届中国植物逆境生理学与分子生物学学术研讨会论文摘要汇编[C];2010年

4 许振国;;海洋ω-3不饱和脂肪酸应用综述[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年

5 孔平;杜茁;孟庆勇;汤波;李宁;;转基因家畜合成多不饱和脂肪酸的小鼠模型[A];中国生物工程学会2006年学术年会暨全国生物反应器学术研讨会论文摘要集[C];2006年

6 刘纳新;余震;;不饱和脂肪酸抗炎作用的研究进展[A];2006年浙江省肠外肠内营养学学术年会论文汇编[C];2006年

7 王忠智;;富集ω-3多不饱和脂肪酸畜产品的研究[A];“科技进步推进畜牧业现代化”科技论文集[C];2011年

8 方志娥;曲斐;尚京川;;高效液相色谱法测定母乳多不饱和脂肪酸[A];2008年成渝药学学术年会论文集[C];2008年

9 魏建东;;多不饱和脂肪酸生物学功效及在畜禽上的应用研究进展[A];2010山东饲料科学技术交流大会论文集[C];2010年

10 孔秀芹;刘志礼;;不饱和脂肪酸的降血脂功能[A];中国藻类学会第十一次学术讨论会论文摘要集[C];2001年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 食讯;n—3多不饱和脂肪酸市场争夺战[N];中国食品报;2014年

2 马学民;消费者如何选择适合自己的食用油?[N];中国食品报;2010年

3 武深秋;老年人不宜谈脂色变[N];云南科技报;2003年

4 ;德国科学家培育出含多不饱和脂肪酸的转基因作物[N];今日信息报;2004年

5 王中;多不饱和脂肪酸摄入过多有害[N];卫生与生活报;2006年

6 孟刚;常吃葵花油 有益心血管[N];中国消费者报;2007年

7 记者 郑灵巧;多不饱和脂肪酸人体不可缺[N];健康报;2010年

8 唐大寒;吃什么油为好[N];家庭医生报;2005年

9 重庆市优胜科技发展有限公司 潘存霞;多不饱和脂肪酸是防病的强力武器[N];中国畜牧兽医报;2013年

10 杨月欣;科学用油有利健康[N];健康报;2004年

中国博士学位论文全文数据库 前9条

1 罗琦霞;Shewanella oneidensis脂肪酸生物合成及其调控的研究[D];浙江大学;2015年

2 李楠;微生物利用甘蔗糖蜜发酵产多不饱和脂肪酸的研究[D];广西大学;2008年

3 赵斌;n-3多不饱和脂肪酸与动脉粥样硬化的实验研究[D];中国协和医科大学;1996年

4 王利华;多不饱和脂肪酸在鸡蛋中沉积及应用效果的研究[D];东北农业大学;2001年

5 张雯婷;OMEGA-3多不饱和脂肪酸在新生大鼠脑缺血缺氧损伤中的作用及机制研究[D];复旦大学;2010年

6 郝薇;Omega-3多不饱和脂肪酸对人肝细胞和巨噬细胞抗炎作用的实验研究[D];山东大学;2012年

7 肖_g君;多不饱和脂肪酸对大血管病变保护作用机制的研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2004年

8 郑征;Omega-3多不饱和脂肪酸通过影响miR-146b的表达实现对炎症的调节[D];青岛大学;2013年

9 郭晓云;ω-3多不饱和脂肪酸对CMS抑郁症大鼠模型神经生化及海马基因表达的影响[D];复旦大学;2007年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 吴琳;液相色谱—质谱联用分离鉴定长链多不饱和脂肪酸甘油三酯[D];中国农业科学院;2015年

2 和丽媛;不同加工方式对禽蛋脂质氧化及脂肪酸的影响[D];华中农业大学;2015年

3 汤世华;高产多不饱和脂肪酸发酵条件优化的研究[D];武汉工业学院;2008年

4 牛之瑞;红松仁多不饱和脂肪酸纯化及功能研究[D];东北林业大学;2008年

5 杜玉兰;鼠尾藻中多不饱和脂肪酸分离与纯化的初步研究[D];广西大学;2008年

6 张超;气质法测功能性食品中多不饱和脂肪酸的研究[D];天津科技大学;2009年

7 崔艺峰;不饱和脂肪酸在牵张增强豚鼠胃窦平滑肌细胞毒蕈碱电流中的作用[D];延边大学;2003年

8 乔立君;多不饱和脂肪酸对大鼠肠道菌群及脂肪代谢相关基因的影响[D];青岛大学;2014年

9 郑晶;马油不饱和脂肪酸提取及富集研究[D];新疆农业大学;2014年

10 蒋艳忠;蚕蛹中蚕蛹油的提取及不饱和脂肪酸的分离研究[D];广西大学;2007年

  本文关键词：Shewanella oneidensis脂肪酸生物合成及其调控的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：441576