碳离子束辐照拟南芥突变体筛选及诱变效应研究

发布时间：2017-06-27 02:11

  本文关键词：碳离子束辐照拟南芥突变体筛选及诱变效应研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：重离子束因其独特的物理学和生物学优势,在辐射育种中具有突变率高、诱变谱广等优点,是植物品种改良的重要手段之一。目前许多农作物的遗传背景不清晰,在一定程度上限制了辐射育种分子机理的研究进展。本研究以模式植物拟南芥为研究对象,采用碳离子束辐照诱变处理,对M2代群体进行突变率及诱变谱量化分析,并对筛选到的稳定突变体#197进行表型、生理生化及非生物胁迫抗性分析,借助全基因组重测序技术分析获取了该突变体在DNA水平上的变异类型及分布特征,结合图位克隆技术探寻引起突变性状的基因。力求从表型和基因组学层面解析碳离子束辐照对拟南芥的诱变生物学效应,进而为重离子束辐照诱变育种提供理论基础。在室温和大气条件下采用能量分别为43.3Me V/u和10.3Me V/u(样品平均LET分别为50 ke V/μm和200 ke V/μm)的碳离子束辐射拟南芥干种子,对拟南芥当代生物学效应进行分析。同一LET条件下,除株高外,存活率、根长、下胚轴长及每果荚种子数均随着辐射剂量的增大呈现出下降趋势;碳离子束的LET值越高,存活率、根长、下胚轴长度及每果荚种子数等指标下降的程度越剧烈。综合考虑,以获取高的突变率及育性良好的突变后代为前提,选取50 ke V/μm,200Gy处理组用于大规模突变筛选。从28602株M2植物材料中筛选到肉眼可识别的表型变异植株共计1363份,变异类型包括4个大类,即叶突变、茎突变、花突变、生长周期突变,每一大类又可分为多种的亚类,统计分析结果显示:碳离子束辐照对拟南芥的总突变率为4.77%,其中叶和生长周期突变比例较高,分别为2.33%和1.57%;而茎和花的突变率则仅为0.27%和0.13%。同时也发现碳离子束辐照对拟南芥具有明显的表型多效性:在筛选到的1363份突变材料中,表现出一种明显表型的突变体所占比率为64%;表现出两种明显表型的突变材料占13.3%;13.1%的突变体表现出3种及3种以上的表型。对碳离子束辐照诱变所获得的稳定遗传突变体#197进行表型深入研究,结果表明营养生长阶段,#197主根长度、下胚轴长度、鲜重及株高均比野生型(Wild type,WT)低。表型组学统计观察显示#197的叶片总面积显著低于WT,叶片荧光强度也较WT弱。#197的第一到第三片真叶比WT面积大,早期生长时中心叶片薄而透,颜色深绿,后期莲座叶片上呈凹凸不平状。对差异叶片进行显微观察发现其内部细胞形态也发生了相应改变。叶绿素荧光检测结果表明与WT相比,#197的PSⅡ活性降低,主要表现为Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR及q P值的下降。此外,#197的生殖生长表现出开花时间晚,花粉活力弱,果荚发育差等特征。借助基因组重测序技术分析并鉴定了#197突变体基因组的序列变异及结构变异信息。测序共产生5.9亿碱基对,平均测序深度达参考基因组的49×。检测出变异主要包括4642个SNP、3071个Indel、79个CNV、288个SV。通过对SNP和Indel在染色体上的分布情况来看,碳离子辐照引起的突变在各染色体上具有一定的偏好性,且主要集中在着丝粒附近,1号染色体上的突变尤为集中。碱基发生A-G、T-C转换与A-C、A-T、G-C、G-T颠换的比值(Ti/Tv)为0.996:1。对变异位点进行GO注释,发现参与生物学途径的基因变异所占比率为47%,参与细胞组分及分子功能的基因变异所占比率分别为27%和26%。利用图位克隆技术,将与#197突变体性状相关的变异位点锁定在1号染色体上的T23K8至F4N2的1832kb范围内以及4号染色体上的F6I18至F8B4的579.773kb的范围内。将图位克隆与基因组重测序结果相结合,确定与#197的突变性状相关的候选基因共计32个。比较了#197突变体与WT对盐及干旱胁迫的敏感性:盐胁迫降低了WT与#197种子的萌发速率却并没有抑制拟南芥的最终萌发率。在幼苗期,盐胁迫处理后,#197绿胚率比WT高,且其脯氨酸合成酶基因P5CS1表达水平显著高于WT。正常条件下,#197与WT的含水量无差异,干旱胁迫后,#197的失水率较WT高,脯氨酸积累量较WT低,某些关键标记基因表达量较WT低,但是二者对干旱胁迫的敏感性在表型上无明显差异。综合以上研究结果表明:1)碳离子束辐照对拟南芥干种子具有明显的当代效应,综合半致死剂量、生长情况及育性等指标,选取50 ke V/μm,200Gy处理组用于大规模突变筛选。2)碳离子束对拟南芥M2群体的总突变率为4.77%,突变谱包括叶突变、茎突变、花突变、生育周期突变,同时碳离子束辐照拟南芥诱发的突变具有明显的表型多效性。3)对稳定遗传的突变体#197进行表型深入研究发现,与野生型植株相比,#197在营养生长及生殖生长阶段均呈现出明显的形态学差异,呈现出生长发育延迟且长势较弱的趋势。4)#197突变体在DNA水平上发生了数目众多的倒位、易位、插入缺失和点突变。5)图位克隆发现与#197表型性状相关的突变基因分别位于1号和4号染色体上。6)#197在幼苗期对盐胁迫敏感性较WT低;虽然表型上#197对干旱胁迫的敏感性与WT无区别,但是其生理指标及胁迫应答基因的表达水平表现出了明显的差异。
【关键词】：碳离子束辐照 拟南芥 突变筛选 诱变效应 全基因组重测序 图位克隆
【学位授予单位】：中国科学院研究生院（近代物理研究所）
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q947.9
【目录】：

• 致谢5-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-19
• 第一章 引言19-55
• 1.1 植物突变体的产生方式及机制19-23
• 1.1.1 自发突变19
• 1.1.2 化学诱变19-20
• 1.1.3 生物手段20-22
• 1.1.3.1 转座子标签法20-21
• 1.1.3.2 T-DNA插入21-22
• 1.1.4 物理手段22-23
• 1.2 重离子束辐射育种介绍23-34
• 1.2.1 重离子束物理学优势23-24
• 1.2.2 重离子束生物学优势24-26
• 1.2.3 重离子束辐照植物的诱变效应26-28
• 1.2.4 重离子束辐照育种研究进展28-34
• 1.3 突变体研究技术34-46
• 1.3.1 图位克隆34-36
• 1.3.1.1 图位克隆原理34-35
• 1.3.1.2 拟南芥图位克隆基本路线35-36
• 1.3.2 高通量测序36-41
• 1.3.2.1 测序技术的发展36-38
• 1.3.2.2 全基因组重测序技术38-41
• 1.3.3 TILLING技术41-43
• 1.3.3.1 TILLING技术原理及基本步骤41-42
• 1.3.3.2 TILLING技术的发展及研究进展42-43
• 1.3.4 表型组学43-46
• 1.4 拟南芥突变体研究进展46-52
• 1.4.1 拟南芥作为模式植物的特征46-48
• 1.4.1.1 植物学特征46-47
• 1.4.1.2 遗传分析特征47-48
• 1.4.2 拟南芥突变表型分类筛选研究进展48-52
• 1.5 植物抗性的产生及分子机制52-53
• 1.6 研究意义53-55
• 第二章 材料和方法55-70
• 2.1 实验材料55
• 2.1.1 拟南芥材料55
• 2.1.2 试剂55
• 2.2 实验方法55-69
• 2.2.1 辐照实验55-56
• 2.2.2 当代生物学效应测定56
• 2.2.3 碳离子束辐照拟南芥突变体筛选56-57
• 2.2.4 突变体表型分析及数据统计57-60
• 2.2.4.1 叶片下表皮细胞印记观察57-58
• 2.2.4.2 叶片亚细胞结构观察58
• 2.2.4.3 叶片细胞结构半薄切片观察58-59
• 2.2.4.4 花粉活力测定59-60
• 2.2.4.5 果荚及种子发育检测60
• 2.2.4.6 叶绿素荧光参数测定60
• 2.2.5 基因组重测序60-62
• 2.2.5.1 DNA提取-试剂盒法60-61
• 2.2.5.2 测序及信息分析61-62
• 2.2.6 基因图位克隆62-65
• 2.2.6.1 定位群体构建62
• 2.2.6.2 基因定位62-65
• 2.2.7 植物材料的Na Cl、ABA及干旱处理65
• 2.2.8 植物体内游离脯氨酸含量的测定65-67
• 2.2.8.1 标准曲线的绘制65-66
• 2.2.8.2 样品的测定66-67
• 2.2.9 荧光定量PCR67-69
• 2.2.9.1 引物设计67
• 2.2.9.2 RNA的提取67-68
• 2.2.9.3 第一链cDNA的合成68-69
• 2.2.9.4 荧光定量反应69
• 2.3 实验数据统计分析69-70
• 第三章 碳离子束辐照对拟南芥的当代效应研究及突变筛选70-82
• 3.1 不同参数的碳离子束辐照对拟南芥M1代存活率的影响70
• 3.2 不同参数的碳离子束辐照对拟南芥M1代根长及下胚轴的影响70-73
• 3.3 不同参数的碳离子束辐照对拟南芥M1代株高的影响73
• 3.4 不同参数的碳离子束辐照对拟南芥M1代育性的影响73-74
• 3.5 突变体筛选74
• 3.6 突变表型分类统计74-77
• 3.7 碳离子束辐照诱变对M2植株群体的表型多效性77-78
• 3.8 讨论78-82
• 3.8.1 碳离子束辐照对拟南芥具有明显的当代效应78-80
• 3.8.2 拟南芥M2群体表型变异丰富80-82
• 第四章 碳离子束辐照诱变获取的拟南芥突变体82-124
• 4.1 突变体#197表型量化统计分析82-84
• 4.2 #197叶片表型变异分析84-89
• 4.2.1 #197莲座叶的形态结构变异84-87
• 4.2.2 #197莲座叶叶绿素荧光检测87-89
• 4.3 #197育性相关变异分析89-91
• 4.4 碳离子束辐照对#197基因组水平的诱变效应91-106
• 4.4.1 #197的DNA质量检测及文库构建91-93
• 4.4.2 Illumina测序clean date基本信息93-94
• 4.4.3 与参考基因组比对94-95
• 4.4.4 变异检测95-104
• 4.4.4.1 SNP和小Indel检测95-96
• 4.4.4.2 SNP和In Del在基因组的空间分布96-101
• 4.4.4.3 CNV和SV分析101-104
• 4.4.5 GO注释104-106
• 4.5 #197基因图位克隆106-110
• 4.5.1 #197的遗传分析106
• 4.5.2 #197图位克隆粗定位与精细定位106-108
• 4.5.3 #197图位克隆与基因组重测序关联分析108-110
• 4.6 #197突变体对氯化钠及干旱处理敏感性初步研究110-117
• 4.6.1 #197突变体对NaCl及干旱胁迫的表型及生理指标分析110-113
• 4.6.1.1 #197突变体对NaCl胁迫的表型敏感性鉴定110-113
• 4.6.1.2 #197突变体对干旱胁迫的表型敏感性鉴定113
• 4.6.2 胁迫响应基因的表达水平检测113-117
• 4.6.2.1 盐胁迫响应基因的表达水平检测114-116
• 4.6.2.2 干旱胁迫响应基因表达水平检测116-117
• 4.7 讨论117-124
• 4.7.1 #197表型发生明显变异117-118
• 4.7.2 碳离子束辐照诱发的突变影响了118-119
• 4.7.3 碳离子束辐照诱发了119-121
• 4.7.4 碳离子束辐照诱发的突变影响了121-124
• 第五章 结论与展望124-127
• 5.1 结论124-125
• 5.2 进一步的工作方向125-127
• 参考文献127-147
• 附录一 缩略词表147-150
• 附录二 在读期间发表文章150-151
• 附录三 个人简历151

【参考文献】

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