利用马铃薯内生菌Bacillus megaterium PE1表达小鼠干扰素-γ和家蚕素Ⅱ的研究

发布时间：2017-06-28 18:00

  本文关键词：利用马铃薯内生菌Bacillus megaterium PE1表达小鼠干扰素-γ和家蚕素Ⅱ的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着生物科技的进步,植物不仅可以为人类提供传统的天然产品,而且已成为表达有医药价值或工业用途的外源蛋白的良好生物反应器,利用植物生物反应器表达外源蛋白,可将外源蛋白富集于种子、块茎、块根等组织器官中,有利于蛋白的分离纯化。由于植物体表达外源蛋白易进行大规模生产,产品获取及加工相对简单,生产成本较低,因此受到人们的广泛重视。但目前将外源基因导入植物的各种方法均有一定的局限性,如操作繁琐费时、外源基因丢失、基因沉默等。因此,开发快速、简便、低成本的外源基因转化方法是研究的重要课题。植物内生菌(endophyte)广泛存在于各种植物组织内,与宿主植物长期互惠共生,人类的植食性食物中均含有内生菌,说明内生菌对人体无害,符合食品安全要求,因此利用转基因内生菌在植物体内表达外源基因可能是一条有效的途径。前人利用工程内生菌在宿主植物中表达的产物主要是抗虫蛋白,而大肠杆菌、巨大芽孢杆菌等原核表达系统的开发则只限于体外培养和表达。为此,本研究从马铃薯(Solanum tuberosum)块茎中分离到一株内生细菌巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium PE1,并以此菌株作为外源基因表达菌,将小鼠(Mus musculus)干扰素-γ(interferonγ,IFNγ)基因和家蚕(Bombyx mori)的家蚕素Ⅱ(bombyxinⅡ,BBXⅡ)基因导入Bacillus megaterium PE1中,进而再回接至马铃薯中,测定了在体外培养及回接到马铃薯植株之后2种外源蛋白的表达情况及表达产物的生理活性。本研究的主要目的旨在探讨使用相对简单的原核生物转化手段,绕过植物转化的过程,利用内生菌实现外源基因在植物中的表达,从而建立一种植物内生菌-宿主植物新型表达系统。主要结果和结论如下:(1)对马铃薯块茎中内生菌进行了分离、鉴定与优势菌筛选。首先比较了无菌水冲洗、75%乙醇、0.1%氯化汞以及次氯酸钠几种不同方法对马铃薯块茎进行表面灭菌的效果,确定用次氯酸钠溶液效果最佳。对马铃薯块茎中的内生菌用LB培养基分离、培养,共获得27株内生细菌(编号分别为PE1-PE27)。对各菌株进行16S rDNA测序鉴定,将测序结果于GenBank进行BLAST,利用GenBank上已登录的序列构建系统进化树。经同源性检测,分离到的27个菌株分属于4个属的7个种,其中芽孢杆菌属(Bacillus)共有17株,假单胞菌属(Pseudomonas)有5株,葡萄球菌属(Staphylococcus)有3株,短状杆菌属(Brachybacterium)有2株,芽孢杆菌属的菌株数占总分离菌株数的63.0%,表现出明显的种群优势,而在芽孢杆菌属的17个菌株中,有10株为巨大芽孢杆菌。而且巨大芽孢杆菌作为异源蛋白表达系统已经有良好的研究基础和诸多优势。因此本研究将巨大芽孢杆菌pe1菌株作为表达外源基因的载体菌,定名为“bacillusmegateriumpe1”。(2)研究了溶菌酶浓度、酶解温度及酶解时间对bacillusmegateriumpe1原生质体形成率及再生率的影响。三种影响因素的单因素试验结果表明,三个因素对pe1原生质体形成率的影响与对再生率的影响呈相反趋势。进一步以原生质体形成率与再生率的乘积作为考察指标,针对三个因素设计正交试验以确定最佳的处理条件,结果显示,三种主要因子的影响程度依次为:温度时间酶量。通过正交试验确定的bacillusmegateriumpe1原生质体最佳制备条件为:溶菌酶浓度4mg/ml,酶解温度30℃,酶解时间90min。(3)研究了小鼠干扰素-γ基因(mifn-γ)导入bacillusmegateriumpe1及其在体外和回接到马铃薯植株中的表达情况。首先克隆了小鼠干扰素-γ基因(mifn-γ)的cdna,构建了重组表达质粒phis1522-mifn-γ,以此重组质粒转化bacillusmegateriumpe1,并用d-xylose诱导mifn-γ的表达,经sds-page及elisa检测均表明,mifn-γ在bacillusmegateriumpe1中获得了表达,表达量为224.6229mg/l。将表达mifn-γ的bacillusmegateriumpe1菌株回接到马铃薯组培苗,回接5d、10d、15d、20d后分别进行检测,均检测到组培苗中有mifn-γ的存在,说明导入mifn-γ基因的bacillusmegateriumpe1菌株能够在马铃薯组培苗中侵染、定殖,并可在马铃薯植株内表达具有活性的外源蛋白。(4)研究了家蚕素Ⅱ基因(bbx-Ⅱ)导入bacillusmegateriumpe1及其在体外和回接到马铃薯植株中的表达情况。首先克隆了家蚕素Ⅱ基因(bbx-Ⅱ)的cdna,构建了重组表达质粒phis1522-bbx-Ⅱ,然后转化bacillusmegateriumpe1,筛选携带bbx-Ⅱ的阳性菌落,以d-xylose诱导bbx-Ⅱ的表达,sds-page检测结果显示,bbxⅡ在bacillusmegateriumpe1中获得了表达。将表达bbxⅡ的bacillusmegateriumpe1菌株回接到马铃薯组培苗,回接5d、10d、15d、20d后分别进行检测,均检测到组培苗中存在bbxⅡ,说明导入bbx-Ⅱ基因的bacillusmegateriumpe1菌株能够在马铃薯组培苗中侵染、定殖,并可在马铃薯植株内表达bbxⅡ。(5)对bacillusmegateriumpe1表达的bbxⅡ进行了纯化和生物活性鉴定。首先将bacillusmegateriumpe1表达的bbxⅡ利用亲和层析获得纯化的bbxⅡ蛋白,配制bbxⅡ注射液,并处理家蚕和小鼠。结果表明,bbxⅡ无论对正常家蚕、饥饿后进食的家蚕还是饲喂高糖饲料诱导的高血糖家蚕,均具有降低血液海藻糖含量及提高海藻糖酶活性的作用。Bacillus megaterium PE1表达的BBXⅡ,对正常小鼠和链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠也均有降血糖的生理活性,其效果与胰岛素相近。(6)本研究结果说明,利用马铃薯内生细菌Bacillus megaterium PE1作为外源基因表达菌,无论在体外还是回接到宿主马铃薯植株内,均能表达外源基因,获得具有生物活性的表达产物,因此建立一种植物内生菌-宿主植物新型基因工程表达系统是可能的。这种表达系统具有构建过程相对简单、成本低、内生菌在宿主植物体内扩散快、用量少、通过常规无性繁殖方法可传递给后代、有些内生菌具有多种宿主植物、对人安全无害等诸多优势,如将对人体有益的外源蛋白基因如疫苗、消化道防御性蛋白等导入内生菌并使其在植物中表达,人食用之后可以起到药食两用的效果,将具有良好的开发前景。但对于导入外源基因的内生菌在回接到宿主植物之后与野生菌的竞争与定殖问题、如何提高外源基因的表达量、如何利用宿主植物的蛋白质合成体系对内生菌合成的外源蛋白进行加工修饰,弥补原核表达体系的不足,从而使内生菌在植物中表达外源活性蛋白这一方法成为兼具原核及真核表达体系双重优点等问题还有待于进一步深入研究。
【关键词】：植物内生细菌 巨大芽孢杆菌PE1菌株 马铃薯 干扰素-γ 家蚕素Ⅱ 外源基因表达系统
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q789;Q943.2
【目录】：

• 符号说明5-11
• 中文摘要11-14
• Abstract14-18
• 1 前言18-42
• 1.1 植物内生菌研究概况18-25
• 1.1.1 植物内生菌概念的发展演变18-19
• 1.1.2 植物内生菌的生物多样性19-21
• 1.1.2.1 植物内生菌种类的多样性19-20
• 1.1.2.2 内生菌宿主植物的多样性20
• 1.1.2.3 内生菌在宿主植物体内存在部位的多样性20-21
• 1.1.3 植物内生菌的生物学作用21-23
• 1.1.3.1 富集营养物质21
• 1.1.3.2 产生植物激素21-22
• 1.1.3.3 产生酶类22
• 1.1.3.4 增强宿主植物的抗性22-23
• 1.1.4 植物内生菌的应用23-25
• 1.1.4.1 植物内生菌作为生物防治因子23-24
• 1.1.4.2 植物内生菌是生物活性物质的资源库24-25
• 1.1.4.3 作为外源基因表达的载体25
• 1.2 巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）的应用研究进展25-30
• 1.2.1 巨大芽孢杆菌在微生物肥料中的应用26
• 1.2.2 巨大芽孢杆菌在环境保护中的应用26-27
• 1.2.2.1 用于水质净化26
• 1.2.2.2 降解残留农药26-27
• 1.2.2.3 治理土壤重金属离子污染27
• 1.2.3 巨大芽孢杆菌在生物活性物质生产中的应用27
• 1.2.4 巨大芽孢杆菌作为原核表达系统27-30
• 1.2.4.1 巨大芽孢杆菌外源蛋白表达系统的优点28
• 1.2.4.2 巨大芽孢杆菌表达系统的发展28
• 1.2.4.3 利用巨大芽孢杆菌表达的外源蛋白28-30
• 1.3 转基因植物作为生物反应器的研究进展30-34
• 1.3.1 利用转基因植物生产的蛋白产品30-33
• 1.3.1.1 疫苗30-31
• 1.3.1.2 抗体31-32
• 1.3.1.3 药用蛋白32
• 1.3.1.4 其他蛋白32-33
• 1.3.2 植物转化的途径33-34
• 1.3.2.1 细胞核转化33
• 1.3.2.2 质体转化33
• 1.3.2.3 植物细胞悬浮液培养33-34
• 1.3.2.4 瞬时表达系统34
• 1.3.3 植物生物反应器的优化34
• 1.4 干扰素-γ 的生理作用及其体外表达的研究进展34-38
• 1.4.1 干扰素-γ 的分子特征35
• 1.4.2 干扰素-γ 的主要功能35-36
• 1.4.2.1 抗病毒作用35-36
• 1.4.2.2 免疫调节作用36
• 1.4.2.3 抗肿瘤作用36
• 1.4.3 重组干扰素-γ 的表达36-38
• 1.4.3.1 重组干扰素-γ 在原核细胞中的表达37-38
• 1.4.3.2 重组干扰素-γ 在昆虫细胞中的表达38
• 1.4.3.3 重组干扰素-γ 在哺乳动物细胞中的表达38
• 1.5 家蚕素Ⅱ的研究进展38-40
• 1.5.1 家蚕素的发现38-39
• 1.5.2 家蚕素Ⅱ的结构与基因特点39
• 1.5.3 家蚕素Ⅱ的生理功能39-40
• 1.6 本研究的目的与意义40-42
• 2 材料与方法42-64
• 2.1 试验材料42-48
• 2.1.1 生物材料42
• 2.1.2 质粒和菌株42
• 2.1.3 生化试剂42-46
• 2.1.3.1 试剂及试剂盒42-43
• 2.1.3.2 主要试剂配制43-46
• 2.1.4 供试家蚕人工饲料和小鼠饲料的配方与加工46
• 2.1.5 PCR引物46
• 2.1.6 主要仪器46-47
• 2.1.7 主要软件及数据库47-48
• 2.2 试验方法48-64
• 2.2.1 马铃薯块茎中内生细菌的分离与鉴定48-51
• 2.2.1.1 马铃薯块茎中内生细菌的分离纯化48-49
• 2.2.1.2 内生细菌 16S rDNA序列测定49-51
• 2.2.1.3 内生细菌系统发育分析51
• 2.2.2 马铃薯内生细菌菌株Bacillus megaterium PE1原生质体制备51-53
• 2.2.2.1 PE1生长曲线的制作51
• 2.2.2.2 原生质体制备及再生方法51-52
• 2.2.2.3 溶菌酶浓度对PE1原生质体形成及再生的影响52
• 2.2.2.4 酶解温度对PE1原生质体形成及再生的影响52
• 2.2.2.5 酶解时间对PE1原生质体形成及再生的影响52
• 2.2.2.6 正交试验优化PE1原生质体形成及再生条件52-53
• 2.2.3 小鼠干扰素-γ 基因的克隆与表达53-60
• 2.2.3.1 小鼠干扰素-γ 基因的克隆53-55
• 2.2.3.2 小鼠干扰素-γ 基因与表达载体pHIS1522的连接55-57
• 2.2.3.3 重组质粒pHIS1522/mIFN-γ 转化PE1的原生质体57-58
• 2.2.3.4 小鼠干扰素-γ 在PE1中的表达58-59
• 2.2.3.5 重组小鼠干扰素-γ 的检测59
• 2.2.3.6 小鼠干扰素-γ 在马铃薯中的表达59-60
• 2.2.3.7 马铃薯中表达小鼠干扰素-γ 的检测60
• 2.2.4 家蚕素Ⅱ基因的克隆与表达60-64
• 2.2.4.1 家蚕素Ⅱ基因的克隆60
• 2.2.4.2 家蚕素Ⅱ基因与表达载体pHIS1522的连接60
• 2.2.4.3 重组质粒pHIS1522/BBX-Ⅱ转化PE160-61
• 2.2.4.4 家蚕素Ⅱ在PE1中的表达61
• 2.2.4.5 SDS-PAGE检测家蚕素Ⅱ的表达61
• 2.2.4.6 家蚕素Ⅱ在马铃薯中的表达61
• 2.2.4.7 马铃薯组培苗中家蚕素Ⅱ的检测61
• 2.2.4.8 PE1表达的家蚕素Ⅱ的纯化与注射液的配制61-62
• 2.2.4.9 PE1表达的家蚕素Ⅱ对家蚕的降血糖作用试验62
• 2.2.4.10 PE1表达的家蚕素Ⅱ对小鼠的降血糖试验62-64
• 3 结果与分析64-94
• 3.1 马铃薯块茎中内生细菌的分离及鉴定64-69
• 3.1.1 表面灭菌方法对马铃薯块茎中内生细菌分离效果的影响64
• 3.1.2 马铃薯块茎中内生细菌的培养及鉴定64-69
• 3.1.2.1 内生细菌 16S rDNA的扩增结果65
• 3.1.2.2 内生细菌 16S rDNA序列系统进化分析与分类鉴定65-69
• 3.2 制备马铃薯内生细菌Bacillus megaterium PE1原生质体69-73
• 3.2.1 Bacillus megaterium PE1的生长曲线69-70
• 3.2.2 溶菌酶浓度对Bacillus megaterium PE1原生质体形成及再生的影响70-71
• 3.2.3 酶解温度对Bacillus megaterium PE1原生质体形成及再生的影响71
• 3.2.4 酶解时间对Bacillus megaterium PE1原生质体形成及再生的影响71-72
• 3.2.5 Bacillus megaterium PE1原生质体形成及再生条件的正交试验优化72-73
• 3.3 小鼠干扰素-γ 在马铃薯内生巨大芽孢杆菌PE1菌株和马铃薯组培苗中的表达73-80
• 3.3.1 小鼠干扰素-γ 基因的克隆73-75
• 3.3.1.1 小鼠淋巴细胞总RNA的提取73
• 3.3.1.2 RT-PCR结果73-74
• 3.3.1.3 重组质粒pEASY-T1 simple/mIFN-γ 的鉴定74-75
• 3.3.1.4 mIFN-γ cDNA序列测定结果75
• 3.3.2 小鼠干扰素-γ 在马铃薯内生巨大芽孢杆菌PE1菌株中的表达75-78
• 3.3.2.1 重组表达质粒pHIS1522/mIFN-γ 的构建76
• 3.3.2.2 重组表达质粒pHIS1522/mIFN-γ 转化PE1原生质体76-77
• 3.3.2.3 小鼠干扰素-γ 在PE1中的表达77-78
• 3.3.3 小鼠干扰素-γ 在回接内生巨大芽孢杆菌PE1的马铃薯组培苗中的表达78-80
• 3.4 家蚕素Ⅱ在马铃薯内生巨大芽孢杆菌PE1菌株和马铃薯组培苗中的表达80-94
• 3.4.1 家蚕素Ⅱ基因的克隆80-83
• 3.4.1.1 家蚕头部总RNA的提取80-81
• 3.4.1.2 RT-PCR结果81
• 3.4.1.3 重组质粒pEASY-T1 simple/BBX-Ⅱ的鉴定81-82
• 3.4.1.4 BBX-Ⅱ cDNA序列测定结果82-83
• 3.4.2 BBX-Ⅱ在马铃薯内生巨大芽孢杆菌PE1菌株中的表达83-87
• 3.4.2.1 重组表达质粒pHIS1522/BBX-Ⅱ的构建83-84
• 3.4.2.2 重组表达质粒pHIS1522/BBX-Ⅱ转化PE1原生质体84-85
• 3.4.2.3 BBXⅡ在B. megateriuim PE1中的表达及纯化85-87
• 3.4.3 BBXⅡ在回接内生巨大芽孢杆菌PE1菌株的马铃薯组培苗中的表达87
• 3.4.4 内生巨大芽孢杆菌PE1菌株表达的家蚕素Ⅱ对家蚕的降血糖作用87-92
• 3.4.4.1 PE1中表达的BBXⅡ对正常家蚕血糖水平及海藻糖酶活性的影响87-89
• 3.4.4.2 PE1中表达的BBXⅡ对饥饿后进食的家蚕血糖和海藻糖酶活性的影响89-91
• 3.4.4.3 PE1中表达的BBXⅡ对高糖饲料诱导的高血糖家蚕的降血糖效果91-92
• 3.4.5 内生巨大芽孢杆菌PE1菌株表达的家蚕素Ⅱ对小鼠的降血糖作用92-94
• 3.4.5.1 PE1表达的BBXⅡ对正常小鼠血糖的影响92
• 3.4.5.2 PE1表达的BBXⅡ对糖尿病小鼠血糖水平的影响92-94
• 4 讨论94-100
• 4.1 马铃薯内生菌种群分析及外源基因表达载体菌株的确定94-96
• 4.2 巨大芽孢杆菌原生质体制备条件的确定96-97
• 4.3 利用转基因内生菌在植物中表达外源基因的可行性及其优势97-98
• 4.4 今后进一步研究的方向98-100
• 5 结论100-102
• 参考文献102-123
• 致谢123-124
• 攻读学位期间发表论文情况124

【共引文献】

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