三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum Bohlin）减数分裂相关基因的系统学分析、表达检测及功

发布时间：2017-06-28 07:00

  本文关键词：三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum Bohlin）减数分裂相关基因的系统学分析、表达检测及功能验证，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：有性生殖是真核生物特有的繁殖方式,减数分裂则是有性生殖的标志性事件。真核生物在地球上分布广泛且适应地球复杂的生存环境,很大程度上依赖于减数分裂前期I同源染色体非姐妹染色单体间的遗传重组。对调控此过程的相关基因的系统学分析可作为判断有性生殖是否存在的重要依据。我们搜索了六大真核生物超群中5个超群的减数分裂相关基因,通过文献选择了24个相对保守的减数分裂关键基因。所选基因广泛存在于已测序或已知EST序列的真核生物,并作用于减数分裂同源重组过程。本研究通过文献选择下载各真核生物超群的模式生物减数分裂关键基因的蛋白质序列,利用贝叶斯建树法对这些基因所编码的蛋白质做了系统学分析,构建了系统演化拓扑树。三角褐指藻是一种广泛分布于水体中的单细胞微藻,基因组测序工作已经完成。由于其含有丰富的多不饱和脂肪酸(PUFAs:polyunsaturated fatty acids)和三酰基甘油(TAGs:triacylglycerols),并且具有其他特殊的生物学特性,成为近年来研究的热点。然而三角褐指藻是否进行有性生殖依然不为人知,这是良种培育和种质保持不能不面对的问题。我们通过同源搜索和系统学分析在三角褐指藻基因组检测出24个减数分裂关键基因的19个(Smc1,Smc2,Sme3,Smc4,Smc5, Hop1,Rad21,Spoll,Rad51,Rad50,Mndl,Pms1,Mre11,Mlh1,Mlh3,Msh2,Msh4, Msh5 and Mer3),其中包括6个减数分裂特异基因(粗体)。这些基因编码的产物蛋白质涉及姐妹染色单体的粘连,同源染色体配对调控,联会复合体的形成,同源染色体非姐妹染色单体的同源重组等多种功能。虽然三角褐指藻中存在减数分裂相关的同源基因,但这些基因是否表达,是否具有相应的功能,通过系统学分析仍然不能得到确切的答案,因此我们在转录组水平上对部分减数分裂关键基因(MND1,MSH4,MSH5,MER3,MRE11,MLH1)及两个减数分裂特异基因的五个同源基因片段(SPO11-1,SPO11-10,DMC1-2, DMC1-9,DMC1-22)进行检测,发现三角褐指藻中这些同源基因均有表达。即使这些基因都表达,但表达产物未必参与减数分裂过程,因此这些基因的功能验证实验必不可少。SPO 11特异调控减数分裂过程中DNA双链断裂点的形成,DMC 1则只在减数分裂过程中促进同源染色体非姐妹染色单体间的交叉互换。我们从三角褐指藻基因组中成功克隆了与这两个基因相似性很高的四个同源基因SPO11-1, SPO11-10,DMC1-2和DMC1-9,并将这些基因转入相应基因的酵母缺陷型菌株,用以验证这些基因是否具有相应减数分裂功能。实验结果表明,SPO11-10具有补救酵母缺陷菌株减数分裂的功能,能够使酵母转化株恢复正常野生型酵母的产孢率,而DMC1同源基因不能使酵母dmcl缺陷型菌株恢复正常野生型酵母产孢率。这四个减数分裂同源基因的功能验证实验结果与这些基因的生物信息学分析结果一致。在目前被公认的无性繁殖生物体内仍然可以检测出与减数分裂特异基因同源的基因,这一结果表明,无性繁殖生物群体很可能是由有性繁殖的祖先“退化”而来,或者该群体具有隐性有性生殖。系统学分析发现三角褐指藻具有9个减数分裂特异基因中的6个,且功能验证实验证实SPO11-10仍然具有相应减数分裂功能,因此,即使三角褐指藻现在主要通过有丝分裂进行细胞增殖而未见减数分裂过程,但也可能具有有性生殖的能力。本论文将四个海洋微藻中减数分裂特异基因的同源基因在酵母相应缺陷型菌株中进行表达,通过互补实验成功验证其功能,结合生物信息学分析以及相关关键基因的表达检测,为不易观察生活史类型的海洋单细胞微藻三角褐指藻生殖方式的判断提供了新的依据,也为没有建立完善遗传操作体系的海洋微藻基因功能研究提供了新的思路。
【关键词】：有性生殖 减数分裂基因 系统学分析 功能验证 三角褐指藻
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 0 前言13-43
• 1 有性生殖的概述13-18
• 1.1 繁殖的概念和类型13-14
• 1.2 细胞增殖的方式14-16
• 1.2.1 无丝分裂14-15
• 1.2.2 有丝分裂15
• 1.2.3 减数分裂15-16
• 1.3 有性生殖的意义16-18
• 2. 判定有性生殖的方法18-29
• 2.1 性过程的形态学证据18-19
• 2.2 性过程的DNA证据19-28
• 2.2.1 染色体的形态和杂合度19-20
• 2.2.2 系统演化不确定性20
• 2.2.3 群体遗传学20-21
• 2.2.4 梅塞尔效应(Meselson effect)21-23
• 2.2.5 转座子(Transposble elements,TEs)23-24
• 2.2.6 比较基因组学24-28
• 2.3 基因功能的验证28-29
• 2.3.1 计算机预测基因功能28-29
• 2.3.2 实验验证基因功能29
• 3 减数分裂相关的基因29-35
• 3.1 减数分裂开始,DNA的复制和同源染色体配对30
• 3.2 减数分裂的进行,同源染色体重组30-34
• 3.3 减数分裂过程的延续34-35
• 4 三角褐指藻研究现状35-41
• 4.1 硅藻的分类地位及研究现状35-39
• 4.2 三角褐指藻的生物学特性及研究现状39-41
• 5. 本实验的目的和意义41-43
• 1 三角褐指藻减数分裂相关基因的系统学研究43-64
• 1.1 材料与方法44-47
• 1.1.1 材料44-45
• 1.1.1.1 数据来源44
• 1.1.1.2 所用的软件、程序44-45
• 1.1.2 方法45-47
• 1.1.2.1 本地数据库的建立及本地搜索45-46
• 1.1.2.2 多序列比对和系统发育分析46-47
• 1.2 结果与讨论47-63
• 1.3 小结63-64
• 2 三角褐指藻(P.tricornutum Bohlin)减数分裂相关基因同源基因的表达分析64-72
• 2.1 材料方法64-69
• 2.1.1 藻种及培养方法64-65
• 2.1.2. 三角褐指藻(P.tricornutum)总RNA的提取65-66
• 2.1.3. DNase处理总RNA,消化基因组DNA66
• 2.1.4. cDNA合成反应(TaKaRa M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit)66-68
• 2.1.4.1 第一链cDNA合成反应66-67
• 2.1.4.2 第二链cDNA合成及平末端化67
• 2.1.4.3 cDNA纯化67-68
• 2.1.5 减数分裂相关基因引物设计与合成68
• 2.1.6 减数分裂相关基因的RT-PCR扩增68-69
• 2.2 结果讨论69-71
• 2.2.1. RNA提取1%琼脂糖电泳检测69-70
• 2.2.2. 减数分裂相关基因的是否表达检测70-71
• 2.3 小结71-72
• 3 三角褐指藻(P.tricornutum Bohlin)SPO11及DMC1同源基因的克隆72-87
• 3.1 材料与方法73-81
• 3.1.1 三角褐指藻(P.tricornutum)基因组总DNA的提取73
• 3.1.2 引物设计及合成73-74
• 3.1.3 质粒的制备和提取74-77
• 3.1.3.1 质粒来源及结构74-76
• 3.1.3.2 质粒制备76
• 3.1.3.3 质粒的提取(碱裂解法小量提取质粒)76
• 3.1.3.4 溶液的配制76-77
• 3.1.4 三角褐指藻基因组目的片段的PCR扩增77
• 3.1.5 PCR产物琼脂糖凝胶回收(回收试剂盒)77-78
• 3.1.6 pYC2 NT/C及PCR产物双酶切及产物纯化回收78
• 3.1.7 连接反应78-79
• 3.1.8 转化79-80
• 3.1.9 阳性克隆的筛选与菌检80
• 3.1.10 阳性克隆的测序80-81
• 3.2 结果与讨论81-86
• 3.2.1 三角褐指藻基因组DNA提取81
• 3.2.2 SPO11及DMC1同源基因全长扩增81-82
• 3.2.3 SPO11同源基因表达载体构建82-83
• 3.2.4 DMC1同源基因表达载体构建83-84
• 3.2.5. 表达载体检验84-86
• 3.3 小结86-87
• 4 三角褐指藻(P.tricornutum)SPO11、DMC1同源基因在酵母(S.cerevisiae)中的功能验证87-107
• 4.1 材料与方法87-96
• 4.1.1 切除三角褐指藻SPO11-1、DMC1-9基因内含子88-91
• 4.1.1.1 三角褐指藻SPO11-1、DMC1-9基因切除内含子原理88-89
• 4.1.1.2 引物设计89
• 4.1.1.3 切除内含子89-90
• 4.1.1.4 DpnI酶切及延伸产物转化E.coli90
• 4.1.1.5 挑阳性单克隆扩大培养、提质粒及产物检测90-91
• 4.1.1.6 阳性克隆测序91
• 4.1.2 三角褐指藻SPO11、DMC1同源基因在酵母中的功能验证91-96
• 4.1.2.1 菌种、培养基和主要试剂91-92
• 4.1.2.2 酵母突变株的鉴定92-94
• 4.1.2.3 二倍体酵母突变株的获得94
• 4.1.2.4 酵母二倍体突变株的流式细胞检测94-95
• 4.1.2.5 酵母高效转化(醋酸锂转化法)95
• 4.1.2.6 酵母转化株的产孢实验95-96
• 4.2. 结果与讨论96-106
• 4.2.1 三角褐指藻SPO11-1、DMC1-9基因内含子的切除96-99
• 4.2.1.1 三角褐指藻SPO11-1、DMC1-9基因切除内含子RCR反应96-97
• 4.2.1.2 内含子切除反应产物的DpnI酶切97-98
• 4.2.1.3 阳性单克隆的扩大培养及质粒检测98-99
• 4.2.2 三角褐指藻SPO11、DMC1同源基因功能验证99-106
• 4.2.2.1 酵母突变株的鉴定99-100
• 4.2.2.2 二倍体酵母突变株的获得及流式细胞检测100-101
• 4.2.2.3 酵母spo11-/-突变株的产孢实验101-104
• 4.2.2.4 酵母dmc1-/-突变株的产孢实验104-106
• 4.3 小结106-107
• 5 结论107-109
• 参考文献109-122
• 附录122-126
• 致谢126-127
• 个人简历127
• 发表的学术论文127

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  本文关键词：三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum Bohlin）减数分裂相关基因的系统学分析、表达检测及功能验证，，由笔耕文化传播整理发布。

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