里氏木霉纤维素酶诱导表达过程中碳源感应机制的研究
发布时间：2017-07-05 17:21
本文关键词：里氏木霉纤维素酶诱导表达过程中碳源感应机制的研究
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【摘要】：木质纤维素是自然界中含量最为丰富的可再生资源,其高效循环利用将有效缓解日益严重的能源资源危机。由纤维素特殊的结构组成所形成的天然抗降解屏障是制约其利用的主要瓶颈。自然界中存在许多纤维素降解微生物,它们能够高效利用纤维素类底物,为纤维素的转化利用提供了一条有效途径。丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)便是纤维素降解微生物中的典型代表。由于木质纤维素为水不溶性底物,里氏木霉如何感应胞外纤维素存在进而触发纤维素酶基因表达以及纤维素来源的信号是如何被感应和传递等问题至今没有明确答案。本论文以里氏木霉纤维素酶诱导表达过程中碳源感应为切入点,分别从纤维二糖转运蛋白和无转运活性的类纤维二糖转运蛋白两方面研究了纤维素酶编码基因启动表达的机理,主要得到以下结果：1.构建了纤维二糖转运蛋白筛选系统,并首次在里氏木霉中鉴定得到具有纤维二糖转运活性的转运蛋白Stpl。利用酿酒酵母不能代谢纤维二糖的特性,通过代谢工程的手段分别在酿酒酵母中表达β-葡萄糖苷酶和候选纤维二糖转运蛋白,并通过重组酵母以纤维二糖为碳源时的生长情况判定候选转运蛋白是否具有纤维二糖转运活性。以此重组酵母为平台,结合生物信息学预测鉴定到了里氏木霉中第一个具有纤维二糖转运活性的转运蛋白,由于它兼有葡萄糖和木糖转运活性,因此将其命名为Sugar Transporter 1,简称Stp1。2.通过基因敲除证明里氏木霉Stp1不仅影响菌体对纤维二糖的利用,同时对里氏木霉纤维素酶基因的表达也有重要的影响。为研究纤维二糖转运蛋白在里氏木霉纤维素酶诱导表达中的作用,通过同源双交换的策略在里氏木霉野生型菌株TU6中对stp1进行敲除,成功得到Stp1缺失突变株△stp1。研究表明,Stp1的缺失一定程度上影响了里氏木霉对纤维二糖的利用,相比于野生型菌株,△stp1以纤维二糖为碳源时生长变慢且最终生物量积累变少。并且Stp 1的缺失致使里氏木霉在纤维素诱导时其纤维素酶基因转录及发酵液纤维素酶酶活大幅度提升；而相反的是△stp1的纤维素酶表达不再受纤维二糖的诱导。进一步分析表明Stp1缺失后对纤维二糖响应的消失是由于胞外β-葡萄糖苷酶酶活升高引起,升高的β-葡萄糖苷酶酶活加速胞外纤维二糖水解,产生更多的葡萄糖从而引起葡萄糖阻遏效应抑制纤维素酶基因的表达。但胞外β-葡萄糖苷酶酶活升高并不是纤维素诱导时△stp1菌株纤维素酶酶活升高的主要原因,且Stp1的缺失并不影响槐糖对纤维素酶的诱导。另外,研究还发现Stp1并不能解除纤维素为碳源时纤维素酶诱导过程中的葡萄糖阻遏效应,至少高浓度葡萄糖存在时Stp1并没有明显的解阻遏作用,考虑到Stp1所具备的葡萄糖转运活性,推测纤维素酶表达过程中Stp1的缺失可能通过减缓葡萄糖向胞内的转运而在一定程度上减缓了葡萄糖阻遏效应的发生,因此使纤维素酶分泌表达加强。3.通过表达谱测序,从全基因组水平上检测了野生型菌株TU6和△stp1在纤维素诱导时的基因转录差异,发现一新的类糖转运蛋白Tr_3405,且其在△stp1中的转录得到上调。为更全面地研究△stp1高纤维素酶活的原因,对野生型菌株和△stp1菌株进行了纤维素诱导下的表达谱测序。野生型菌株755个基因受Avicel诱导上调表达,其中包括17个纤维素酶编码基因和28个半纤维素酶编码基因。受Avicel诱导上调的这些基因中有98个基因为分泌蛋白编码基因；21个预测为转录调控因子；31个基因编码转运蛋白,其中这31个转运蛋白中有17个与Stp1一样属于MFS超家族；还有30个基因与蛋白分泌有关；另外的282个基因属于未知功能蛋白编码基因。整体表达谱测序结果显示,△stp1中的基因表达谱与野生型菌株相比有697个基因的表达有明显差别,其中包括139个表达上调基因和532个下调表达的基因。差异基因中预测为糖转运蛋白的MFS超家族的Tr 3405受纤维素诱导上调表达十分显著,而且其在△stp1中转录水平进一步升高。荧光定量PCR和Northern blot实验进一步验证了Tr 3405受纤维素诱导而发生上调表达。4.通过过表达和基因敲除,证明类糖转运蛋白Tr_3405是里氏木霉纤维素酶诱导表达所必须的调节因子,将其命名为Cellulase regulating transporter 1,简称Crtl。荧光定量PCR结果显示当Tr 3405过表达时可以显著提高纤维素酶基因的转录水平。进一步通过同源双交换策略对Tr 3405进行敲除,发现Tr 3405的缺失致使里氏木霉不论是在纤维素、纤维二糖为底物还是槐糖诱导的条件下其纤维素酶均不再表达,由此说明Tr 3405是里氏木霉纤维素酶诱导表达所必须的调节因子。生物信息学分析显示Tr 3405在进化上与粗糙脉孢菌纤维二糖转运蛋白Cdt1和Cdt2及乳酸克鲁维属酵母乳糖转运蛋白Lacl2具有较高的一致性。但是纤维二糖和槐糖转运实验表明Tr 3405并不具有纤维二糖或槐糖转运活性。因此,Tr 3405可能是以无转运活性类转运蛋白的形式参与胞外诱导信号的感应。由此,我们将Tr 3405蛋白命名为类转运蛋白纤维素酶调节因子(Cellulase regulating transporter 1,简称Crt1)。通过pull-down实验钓取了与Crt1相互作用的蛋白,进一步研究Crt1的信号感应与传递的分子机制,初步结果表明Crt1的C端并不稳定,这可能与Crt1的信号传递功能有关,更深入的实验结果待进一步分析。5.发现了一种新型纤维素酶诱导碳源一葡萄糖酸内酯。本论文研究发现葡萄糖酸内酯拥有略高于纤维二糖的纤维素酶诱导效果,且能够作为唯一碳源供里氏木霉生长,这是迄今为止发现的第一个单糖衍生物类的纤维素酶诱导物。研究表明,葡萄糖酸内酯诱导纤维素酶表达需要Crt1和纤维素酶基因关键转录因子Xyrl的参与,不论是Crt1还是Xyr1的缺失都会消除葡萄糖酸内酯对纤维素酶的诱导表达。进一步研究表明,胞内β-葡萄糖苷酶Cell a在葡萄糖酸内酯诱导纤维素酶表达过程中至关重要,它的缺失致使菌体在葡萄糖酸内酯诱导下其纤维素酶不再表达,而胞外β-葡萄糖苷酶Bgl1并不影响葡萄糖酸内酯的诱导。与纤维素的诱导不同,葡萄糖酸内酯诱导纤维素酶的表达受Stp1正调控,Stpl的缺失会大幅度削弱葡萄糖酸内酯为碳源时纤维素酶的表达水平,初步试验证明这与Stp1的转运活性有关。本论文发现了里氏木霉中第一个纤维二糖转运蛋白Stp1并首次报道了纤维素酶表达调控的关键类纤维二糖转运蛋白Crtl,这为后续的纤维素酶表达调控过程中碳源感应的研究提供了良好的开端。综合以上结果初步得到以下模型：环境中的纤维素类底物,在本底表达的纤维素酶作用下释放微量的纤维二糖,这些纤维二糖与定位于细胞膜上的Crtl相结合后形成的纤维素酶诱导信号经下游信号途径的传递最终进入细胞核激活纤维素酶的表达。Stp1是位于细胞膜上的纤维二糖／葡萄糖转运蛋白,其缺失突变造成最初形成的微量纤维二糖在胞外积累加强了Crtl参与的纤维素酶诱导信号的产生,促进了纤维素诱导下纤维素酶的表达；纤维素酶表达启动后胞外产生的纤维二糖一部分被转运进入胞内另一部分在胞外被水解成少量的葡萄糖,Stp1的缺失抑制了葡萄糖向胞内的转运也相应抑制了葡萄糖阻遏效应的发生,因此一定程度上促进了纤维素酶的表达。
【关键词】：里氏木霉 纤维素 纤维素酶 转运蛋白 类转运蛋白 碳源感应 葡萄糖酸内酯
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q936
【目录】：
- 摘要7-11
- Abstract11-16
- 缩略词16-17
- 第一章 绪论17-34
- 1.1 纤维素的结构与性质17
- 1.2 纤维素降解微生物17-19
- 1.2.1 纤维素降解细菌18
- 1.2.2 纤维素降解古菌18
- 1.2.3 纤维素降解真菌18-19
- 1.3 里氏木霉纤维素酶诱导表达19-22
- 1.3.1 里氏木霉纤维素酶系组成19-20
- 1.3.2 里氏木霉纤维素酶的表达调控20-22
- 1.4 真核生物碳源感应受体蛋白分类22-28
- 1.4.1 转运蛋白介导的碳源感应23-24
- 1.4.2 无转运活性的类转运蛋白介导的碳源感应24-25
- 1.4.3 G-蛋白偶联受体介导的碳源感应25-26
- 1.4.4 碳源感受器之间的关系26-28
- 1.5 碳源感应在里氏木霉纤维素酶诱导过程中的作用28-32
- 1.5.1 纤维素酶诱导型碳源28-29
- 1.5.2 纤维素酶诱导假说29
- 1.5.3 参与纤维素酶表达的碳源感应系统的研究29-32
- 1.6 立题依据及研究内容32-34
- 第二章 里氏木霉纤维二糖和乳糖转运蛋白的筛选34-52
- 2.1 材料和方法35-41
- 2.1.1 菌种和质粒35
- 2.1.2 引物35-37
- 2.1.3 培养基和培养条件37
- 2.1.4 菌种保藏37-38
- 2.1.5 实验步骤38-41
- 2.2 结果与讨论41-50
- 2.2.1 纤维二糖/乳糖转运蛋白筛选系统受体菌的构建41-43
- 2.2.2 纤维二糖/乳糖转运蛋白筛选系统阳性对照菌株构建43-44
- 2.2.3 候选转运蛋白纤维二糖/乳糖转运活性测定44-48
- 2.2.4 Tr_47710生物信息学分析48-50
- 2.3 本章小结50-52
- 第三章 里氏木霉糖转运蛋白Stp1基因缺失菌性质测定及机理探究52-98
- 3.1 材料和方法52-66
- 3.1.1 菌种和质粒52
- 3.1.2 本章引物52-54
- 3.1.3 培养基和培养条件54
- 3.1.4 实验步骤54-66
- 3.2 结果与讨论66-95
- 3.2.1 里氏木霉糖转运蛋白编码基因stp1敲除质粒的构建66-67
- 3.2.2 糖转运蛋白基因stp1的敲除67-69
- 3.2.3 糖转运蛋白Stp1基因缺失菌生长测定69-70
- 3.2.4 △stp1菌株纤维素酶活及Cbh Ⅰ表达测定70-72
- 3.2.5 △stp1菌株纤维素酶相关编码基因转录检测72-73
- 3.2.6 Stp1缺失对纤维二糖诱导纤维素酶的影响73-75
- 3.2.7 Stp1缺失对纤维二糖代谢和转运的影响75-78
- 3.2.8 Bgl1对△stp1菌株响应纤维二糖的影响78-82
- 3.2.9 Bgl1对△stp1菌株纤维素降解的影响82-84
- 3.2.10 Stp1对纤维素酶诱导过程中葡萄糖阻遏的影响84-86
- 3.2.11 与Stp1相互作用蛋白的筛选86-95
- 3.3 本章小结95-98
- 第四章 里氏木霉Stp1缺失突变株表达谱分析98-112
- 4.1 材料和方法98-101
- 4.1.1 菌种98-99
- 4.1.2 本章引物99
- 4.1.3 培养基和培养条件99
- 4.1.4 实验方法99-100
- 4.1.5 基因表达水平研究100-101
- 4.2 结果与讨论101-110
- 4.2.1 送测RNA样品的纯度和浓度检测结果101-102
- 4.2.2 表达谱测序质量分析102-103
- 4.2.3 差异表达基因统计103-108
- 4.2.4 Tr_3405转录上调验证108-109
- 4.2.5 Tr_3405生物信息学分析109-110
- 4.3 本章小结110-112
- 第五章 Tr_3405的基因敲除及其对纤维素酶表达的影响112-136
- 5.1 材料和方法112-116
- 5.1.1 菌种和质粒112-113
- 5.1.2 本章引物113-114
- 5.1.3 培养基及培养条件114
- 5.1.4 实验方法114-116
- 5.2 结果与讨论116-133
- 5.2.1 里氏木霉中Tr_3405的过表达116-118
- 5.2.2 Tr_3405在里氏木霉中的敲除118-120
- 5.2.3 Tr_3405缺失突变株表型测定120-127
- 5.2.4 △crt1菌株中Xyr1的表达分析127-128
- 5.2.5 Crt1相互作用蛋白pull-down钓取128-133
- 5.3 纤维素酶诱导表达过程中碳源感应模型133-135
- 5.4 本章小结135-136
- 第六章 一种新型纤维素酶诱导碳源—葡萄糖酸内酯136-147
- 6.1 材料和方法136-138
- 6.1.1 菌种136-137
- 6.1.2 引物137
- 6.1.3 培养基和培养条件137-138
- 6.1.4 实验方法138
- 6.2 结果和讨论138-145
- 6.2.1 葡萄糖酸内酯能够诱导里氏木霉纤维素酶表达138-139
- 6.2.2 葡萄糖酸内酯可以作为碳源供里氏木霉生长139-140
- 6.2.3 葡萄糖酸内酯诱导纤维素酶表达需要Xyr1和Crt1的存在140-142
- 6.2.4 Cel1a在葡萄糖酸内酯诱导纤维素酶表达过程起到至关重要的作用142-143
- 6.2.5 葡萄糖酸内酯诱导纤维素酶表达受糖转运蛋白Stp1影响143-145
- 6.2.6 葡萄糖酸内醋诱导纤维素酶表达模型145
- 6.3 本章小结145-147
- 全文总结及展望147-149
- 参考文献149-160
- 致谢160-161
- 攻读博士学位期间发表的学术论文161-162
- 附件162-181
- 学位论文评阅及答辩情况表181
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